1. Alkuymmärrys

Tässä vaiheessa meidän on ymmärrettävä joitain käsitteitä ja terminologiaa, jotta vältytään tekemästä virheitä ikäihmistemme edessä, kuten:

K: Mitä eroa on RT-PCR:n, qPCR:n, reaaliaikaisen PCR:n ja reaaliaikaisen RT-PCR:n välillä?

Vastaus: RT-PCR on käänteistranskriptio-PCR(käänteistranskriptio-PCR, RT-PCR), joka on laajalti käytetty muunnos polymeraasiketjureaktiosta (PCR).RT-PCR:ssä RNA-juoste käänteistranskriptoidaan komplementaariseksi DNA:ksi, jota sitten käytetään templaattina DNA:n monistamiseen PCR:llä.
Reaaliaikainen PCR ja qPCR(Kvantitatiivinen Rea-ltime-PCR) ovat sama asia, molemmat ovat reaaliaikaisia ​​kvantitatiivisia PCR, mikä tarkoittaa, että jokaisessa PCR-syklissä on reaaliaikaiset tietueet, joten aloitusmallien määrää voidaan säätää tarkkaan analyysiin.

Vaikka sekä reaaliaikainen PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) että käänteistranskriptio-PCR (käänteistranskriptio-PCR) näyttävät olevan lyhenne RT-PCR, kansainvälinen käytäntö on: RT-PCR viittaa erityisesti käänteistranskriptioon.PCR, reaaliaikainen PCR on yleensä lyhennetty nimellä qPCR (quantitative real-time PCR).

Ja reaaliaikainen RT-PCR (RT-qPCR), se on käänteistranskriptio-PCR yhdistettynä fluoresoivaan kvantitatiiviseen tekniikkaan: hanki ensin cDNA (RT) RNA:n käänteistranskriptiosta ja käytä sitten reaaliaikaista PCR:ää kvantitatiiviseen analyysiin (qPCR).Useimmat laboratoriot tekevät RT-qPCR:ää eli RNA:n ilmentymisen alasäätelyä koskevaa tutkimusta, joten qPCR, josta kaikki puhuvat laboratoriossa, viittaa itse asiassa RT-qPCR:ään, mutta älä unohda, että kliinisissä sovelluksissa on vielä monia DNA-testejä.Kvantitatiivinen analyysi, kuten hepatiitti B -viruksen HBV-detektio.

Kysymys: Kun on luettu paljon fluoresoivaa kvantitatiivista PCR:ää, miksi monistettua fragmenttia pitäisi kontrolloida alueella 80-300 bp?

Vastaus: Kunkin geenisekvenssin pituus on erilainen, jotkut ovat useita kb, toiset satoja bp, mutta meidän tarvitsee vain vaatia tuotteen pituuden olevan 80-300 bp alukkeita suunniteltaessa, liian lyhyt tai liian pitkä ei sovellu fluoresoivaan kvantitatiiviseen PCR-detektioon.Tuotefragmentti on liian lyhyt erotettavaksi aluke-dimeeristä.Aluke-dimeerin pituus on noin 30-40 bp, ja on vaikea erottaa, onko se aluke-dimeeri vai tuote, jos se on alle 80 bp.Jos tuotefragmentti on liian pitkä, yli 300 bp, se johtaa helposti alhaiseen amplifikaatiotehokkuuteen eikä pysty havaitsemaan tehokkaasti geenin määrää.

Kun esimerkiksi lasket, kuinka monta ihmistä luokkahuoneessa on, sinun tarvitsee vain laskea kuinka monta suuta on.Sama pätee, kun havaitset geenejä, sinun tarvitsee vain havaita tietty geenisekvenssi edustaaksesi koko sekvenssi.Jos haluat laskea ihmisiä, sinun on laskettava sekä suut että nenät, korvat ja lasit, ja virheitä on helppo tehdä.

Laajennettavaksi, biologisessa tutkimuksessa on monia tutkimustapauksia pisteestä alueelle, koska minkä tahansa lajin geenisekvenssi on erittäin pitkä, on tarpeetonta ja mahdotonta mitata kaikkia fragmentteja, kuten bakteerien 16S-sekvensointi, joka on bakteerien konservatiivisen sekvenssin suorittaminen Määritykset tietyn bakteeripopulaation päättelemiseksi.

K: Mikä on optimaalinen pituus qPCR-alukkeen suunnittelulle?

Vastaus: Yleisesti ottaen alukkeen pituus on noin 20-24 bp, mikä on parempi.Pohjusteen TM-arvoon on tietysti kiinnitettävä huomiota aluketta suunniteltaessa, koska tämä liittyy optimaaliseen hehkutuslämpötilaan.Monien kokeiden jälkeen on todistettu, että 60°C on parempi TM-arvo.Jos hehkutuslämpötila on liian alhainen, se johtaa helposti epäspesifiseen vahvistukseen.Jos hehkutuslämpötila on liian korkea, vahvistusteho on suhteellisen alhainen, vahvistuskäyrän huippu alkaa myöhemmin ja CT-arvo viivästyy.

K: Miten väriainemenetelmä eroaa koetinmenetelmästä?

Vastaus: VäriainemenetelmäJotkin fluoresoivat väriaineet, kuten SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO jne., eivät säteile valoa itsestään, mutta lähettävät fluoresenssia sitoutuessaan kaksijuosteisen DNA:n pienempään uraan.Siksi kone ei pysty havaitsemaan fluoresoivaa signaalia PCR-reaktion alussa.Kun reaktio saavuttaa pariutumis-pidennysvaiheen, kaksoisjuoste avautuu ja uusi juoste syntetisoituu DNA-polymeraasin vaikutuksesta, ja fluoresoiva molekyyli sitoutuu dsDNA:n pienempään uraan.PCR-syklien määrän kasvaessa yhä useampia väriaineita yhdistetään kaksijuosteiseen DNA:han, ja myös fluoresoiva signaali paranee jatkuvasti.Väritysmenetelmää käytetään pääasiassa tieteellisessä tutkimuksessa.
PS: Ole varovainen koetta tehdessäsi, väriaine on yhdistettävä ihmisen DNA:han, ole varovainen muuttaessasi siitä fluoresoivaksi henkilöksi.

Väritysmenetelmä (vasemmalla) Koetinmenetelmä (oikealla)
PS: Ole varovainen koetta tehdessäsi, väriaine on yhdistettävä ihmisen DNA:han, ole varovainen muuttaessasi siitä fluoresoivaksi henkilöksi.

SYBR Green Ⅰ sitoutuu DNA:n pienempään uraan

Anturin menetelmäTaqman-koetin on yleisimmin käytetty hydrolyysikoetin.Koettimen 5'-päässä on fluoresoiva ryhmä, yleensä FAM, ja itse koetin on kohdegeenille komplementaarinen sekvenssi.3′-päässä on fluoresoiva sammutusryhmä.Fluoresenssiresonanssienergian siirron periaatteen mukaan (Förster resonance energy transfer, FRET), kun reportteri fluoresoiva ryhmä (luovuttajafluoresoiva molekyyli) ja sammuttava fluoresoiva ryhmä (akseptorifluoresoiva molekyyli) viritetään Kun spektrit menevät päällekkäin ja etäisyys luovuttajan fluoresenssimolekyylistä on hyvin lähellä (7-10 nm) ule, kun taas autofluoresenssi on heikentynyt.Siksi PCR-reaktion alussa, kun koetin on vapaa ja ehjä järjestelmässä, reportterifluoresoiva ryhmä ei lähetä fluoresenssia.Hehkutuksen aikana aluke ja koetin sitoutuvat malliin.Pidennysvaiheen aikana polymeraasi syntetisoi jatkuvasti uusia ketjuja.DNA-polymeraasilla on 5′-3′-eksonukleaasiaktiivisuutta.Kun DNA-polymeraasi saavuttaa koettimen, se hydrolysoi koettimen templaatista, erottaa reportterifluoresoivan ryhmän sammuttajafluoresoivasta ryhmästä ja vapauttaa fluoresoivan signaalin.Koska koettimen ja mallineen välillä on yksi-yhteen suhde, koetinmenetelmä on värjäysmenetelmää parempi testin tarkkuuden ja herkkyyden suhteen.Koetinmenetelmää käytetään pääasiassa diagnoosissa.

K: Mikä on absoluuttinen kvantifiointi?Mikä on suhteellinen kvantifiointi?

Vastaus: Absoluuttinen kvantifiointi viittaa qPCR:llä testattavan näytteen alkuperäisen kopiomäärän laskemiseen, kuten kuinka monta HBV-virusta on 1 ml:ssa verta.Suhteellisen kvantifioinnin tulos on kohdegeenin määrän muutos tietyssä näytteessä suhteessa toiseen vertailunäytteeseen, ja geenin ilmentyminen on säädelty ylös- tai alaspäin.

K: Vaikuttaako RNA:n uuttamisen määrä, käänteistranskription tehokkuus ja monistustehokkuus koetuloksiin?
K: Vaikuttavatko näytteiden säilytys, uuttoreagenssit, käänteistranskriptioreagenssit ja valoa läpäisevät tarvikkeet koetuloksiin?
K: Millä menetelmällä voidaan korjata kokeelliset tiedot?

Mitä tulee näihin ongelmiin, kuvailemme niitä yksityiskohtaisesti alla olevissa lisä- ja lisäosissa.
2. Edistynyt tieto

Mitä tulee reaaliaikaiseen fluoresoivaan kvantitatiiviseen PCR:ään, meidän on tunnustettava tosiasia, että joka vuosi julkaistaan ​​tuhansia tieteellisiä tutkimuksia, joista fluoresoiva kvantitatiivinen PCR-tekniikka ei ole pieni määrä.

Jos fluoresoivan kvantitatiivisen PCR-kokeen mittaamiseen ei ole yhteistä standardia, tulokset voivat vaihdella suuresti.Saman lajin samalle geenille samalla prosessointimenetelmällä havaitsemistulokset vaihtelevat myös suuresti, ja myöhään tulokkaiden on vaikea toistaa samoja tuloksia.Sinä Kukaan ei tiedä mikä on oikein ja mikä väärin.

Tarkoittaako tämä, että fluoresoiva kvantitatiivinen PCR on huijaustekniikka vai epäluotettava tekniikka?Ei, se johtuu siitä, että fluoresoiva kvantitatiivinen PCR on herkempi ja tarkempi, ja hieman väärä toiminta tuottaa täysin päinvastaisia ​​tuloksia.Pieni menetys on tuhannen mailin päässä.Arvioijat voivat kiduttaa artikkelin kirjoittajaa toistuvasti.Samalla lehden arvioijien on vaikea valita eri koetuloksista.

Kaiken kaikkiaan viittaa yksimielisyyden puutteeseen reaaliaikaisissa PCR-kokeissa.Tätä varten alan johtavat tutkijat alkoivat muotoilla standardeja,vaatia kirjoittajia toimittamaan joitain tarvittavia kokeellisia ja tietojenkäsittelytietoja (mukaan lukien tarvittavat tiedot) artikkelissa näiden standardien noudattamiseksi.

Arvostelijat voivat arvioida kokeen laadun lukemalla nämä tiedot;Tulevat lukijat voivat myös käyttää tätä kokeilun toistamiseen tai kokeilun parantamiseen.Silloin tällä tavalla saadut kokeelliset tulokset ovat täynnä tietoa, laadukkaita ja käyttökelpoisia.

MIBBI (minimitiedot biologisille ja biolääketieteellisille tutkimuksille -http://www.mibbi.org) syntyi.MIBBI on projekti, joka tarjoaa standardeja kokeille.Se julkaistaan ​​luonnossa.Tämä projekti on suunnattu erilaisiin biologisiin kokeisiin, mukaan lukien solubiologia, Microarray, qPCR, joista keskustelemme nyt jne., ja se sisältää jokaisen kokeen tyypin lähetettäessä käsikirjoituksia.Nämä tiedot on annettava aina.

MIBBI-projektissa on kaksi artikkelia, jotka liittyvät fluoresoivaan kvantitatiiviseen PCR:ään, nimittäin:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – jäsennelty kieli- ja raportointiopas reaaliaikaista kvantitatiivista PCR-tietoa varten;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – vähimmäistiedot reaaliaikaisia ​​kvantitatiivisia PCR-kokeita koskevien artikkeleiden julkaisemista varten.
Ensin puhutaan RDML:stä, terminologian määrittelystä.

Jos kaikelle ei ole vakiomääritelmää, keskustelua on mahdotonta jatkaa, minkä vuoksi termien selittäminen on kokeessa niin tärkeää.
Fluoresoivassa kvantitatiivisessa PCR-kokeessa käytetty terminologia sisältää seuraavan sisällön.QIAGEN on tehnyt meille parhaan yhteenvedon.Seuraavat ovat kaikki kuiviatavaroita .

Vahvistuskäyrä
Amplifikaatiokäyrä viittaa PCR-prosessin aikana tehtyyn käyrään, jossa syklin numero on abskissa ja reaaliaikainen fluoresenssin intensiteetti reaktion aikana ordinaattana.

Erinomaisella vahvistuskäyrällä tulisi olla seuraavat ominaisuudet: perusviiva on tasainen tai hieman laskenut, eikä ilmeistä nousevaa trendiä ole;käyrän käännepiste on selkeä ja eksponentiaalisen vaiheen kaltevuus on verrannollinen vahvistustehoon.Mitä suurempi kaltevuus, sitä suurempi vahvistusteho;yleinen vahvistuskäyrä Yhdensuuntaisuus on hyvä, mikä osoittaa, että kunkin putken vahvistusteho on samanlainen;pienipitoisuuksien näytteiden vahvistuskäyrän eksponentiaalinen vaihe on ilmeinen.

Perustaso (perusviiva)
Perustaso on alkujakson melutaso, mitataan yleensä 3. ja 15. syklin välillä, koska amplifikaatiotuotteen aiheuttamaa fluoresenssiarvon nousua ei voida havaita tänä aikana.Perustason laskemiseen käytettyjen syklien lukumäärää voidaan vaihdella ja sitä voidaan joutua vähentämään, jos käytetään suuria templaattimääriä tai jos kohdegeenin ilmentymistaso on korkea.

Perustason asettaminen edellyttää fluoresenssitietojen tarkastelua lineaarisuuden vahvistuskäyrästä.Perusviiva asetetaan siten, että vahvistuskäyrän kasvu alkaa syklin numerolla, joka on suurempi kuin perusviivan syklin huippuluku.Perustasot on asetettava erikseen kullekin kohdesekvenssille.Varhaisissa sykleissä havaitut keskimääräiset fluoresenssiarvot on vähennettävä monistetuissa tuotteissa saaduista fluoresenssiarvoista.Erilaisten reaaliaikaisten PCR-ohjelmistojen uusimmat versiot mahdollistavat yksittäisten näytteiden perusasetusten automaattisen optimoinnin.

PCR-monistusreaktion muutaman ensimmäisen syklin aikana fluoresenssisignaali ei muutu paljon.Suoraa lähestymistä kutsutaan perusviivaksi, mutta jos katsomme tarkasti muutaman ensimmäisen syklin, näemme, että perusviivan sisällä tapahtuu mitä alla olevassa kuvassa.

Tausta Tausta viittaa
reaktion epäspesifinen fluoresenssiarvo.Esimerkiksi: tehoton fluoresenssin sammutus;tai suuri määrä kaksijuosteisia DNA-templaatteja SYBR Greenin käytöstä johtuen.Signaalin taustakomponentit poistetaan matemaattisesti Real-Time PCR -ohjelmistoalgoritmilla.

Toimittajan signaali
Reportterisignaali viittaa fluoresoivaan signaaliin, jonka SYBR Green tai fluoresoivasti leimattu sekvenssispesifinen koetin tuottaa reaaliaikaisen PCR:n aikana.

Normalized Reporter Signal (RN)
RN viittaa reportterivärin fluoresenssin intensiteettiin jaettuna passiivisen vertailuvärin fluoresenssin intensiteetillä, joka mitataan kussakin syklissä.

Passiivinen vertailuväri
Joissakin reaaliaikaisissa PCR:issäfluoresoivaa väriainetta ROX käytetään sisäisenä referenssinä fluoresoivan signaalin normalisoimiseksi.Se korjaa epätarkoista pipetoinnista, kuopan sijainnista ja fluoresenssin vaihteluista johtuvat vaihtelut kaivokohtaisesti.

Fluoresenssin kynnys (kynnys)
säädettiin tausta-arvon yläpuolelle ja merkittävästi alle vahvistuskäyrän tasannearvon.Sen on sijaittava amplifikaatiokäyrän lineaarisella alueella, joka edustaa PCR:n havaitsemisen log-lineaarista aluetta.Kynnykset tulee asettaa log-amplifikaatiokäyränäkymässä, jotta PCR:n log-lineaarinen vaihe on helposti tunnistettavissa.Jos reaaliaikaisessa PCR:ssä on useita kohdegeenejä, kynnys on asetettava kullekin kohteelle.Yleensä PCR-reaktion 15 ensimmäisen syklin fluoresenssisignaalia käytetään fluoresenssin taustasignaalina, ja fluoresenssikynnys on 10 kertaa fluoresenssisignaalin standardipoikkeama PCR:n 3 - 15 ensimmäisen syklin aikana, ja fluoresenssikynnys asetetaan PCR:n eksponentiaalisessa amplifikaatiovaiheessa.Yleensä jokaiselle instrumentille on asetettu fluoresenssikynnys ennen käyttöä.

Cycle Threshold (CT) tai Crossing Point (CP)
Jakso, jossa vahvistuskäyrä ylittää kynnyksen (eli pisteen, jossa fluoresenssin havaitseminen lisääntyy merkittävästi).CT voi olla murto-osa ja aloitusmallin määrä voidaan laskea.CT-arvo edustaa kokeneiden jaksojen määrää, kun fluoresoiva signaali kussakin PCR-reaktioputkessa saavuttaa asetetun kynnyksen.Kunkin mallin CT-arvon ja mallin alkuperäisen kopionumeron logaritmin välillä on lineaarinen suhde.Mitä suurempi alkuperäinen kopioluku, sitä pienempi on CT-arvo ja päinvastoin.Standardikäyrä voidaan tehdä käyttämällä standardia, jolla on tunnettu alkukopionumero, jossa abskissa edustaa CT-arvoa ja ordinaatta edustaa alkuperäisen kopioluvun logaritmia.Siksi niin kauan kuin tuntemattoman näytteen CT-arvo saadaan, näytteen alkuperäinen kopioluku voidaan laskea standardikäyrästä.

ΔCT-arvo
ΔCT-arvo kuvaakohdegeenin ja vastaavan endogeenisen vertailugeenin CT-arvon välinen ero, kuten taloudenhoitogeeni, ja sitä käytetään normalisoimaan käytetyn mallin määrää:
⇒ΔCT = CT (kohdegeeni) – CT (endogeeninen vertailugeeni)

ΔΔCT-arvo
ΔΔCT-arvo kuvaa eroa kiinnostavan näytteen (esim. stimuloidut solut) keskimääräisen ΔΔCT-arvon ja vertailunäytteen (esim. stimuloimattomat solut) keskimääräisen ΔΔCT-arvon välillä.Vertailunäytettä kutsutaan myös kalibrointinäytteeksi ja kaikki muut näytteet normalisoidaan tähän suhteellista kvantifiointia varten:
⇒ΔΔCT = keskimääräinen ΔCT (kiinnostava näyte) – keskimääräinen ΔCT (vertailunäyte)

Endogeeniset vertailugeenit (endogeeniset vertailugeenit)
Endogeenisten vertailugeenien, kuten taloudenhoitogeenien (kotipitogeenit), ilmentymistasot eivät eroa näytteiden välillä.Vertailugeenin CT-arvojen vertaaminen kohdegeeniin mahdollistaa kohdegeenin ilmentymistaso normalisoinnin syöte-RNA:n tai cDNA:n määrään (katso ΔCT-arvoja koskeva osa yllä).

Sisäiset vertailugeenit sopivatmahdollinen RNA:n hajoaminen tai entsyymi-inhibiittoreiden läsnäolo RNA-näytteissä sekä vaihtelut RNA-sisällössä, käänteistranskription tehokkuus, nukleiinihappojen talteenotto ja näytteen käsittely.Optimaalisen vertailugeenin (geenien) valitsemiseksi muokkasimme algoritmia, jotta se voi valita optimaalisen referenssin kokeellisesta asetuksesta riippuen.

Sisäinen kontrolli
Kontrollisekvenssi, joka monistetaan samassa reaktiossa kuin kohdesekvenssi ja tutkitaan eri koettimella (eli suorittamalla dupleksi-PCR).Sisäisiä kontrolleja käytetään usein sulkemaan pois epäonnistuneet vahvistukset, kuten silloin, kun kohdesekvenssiä ei havaita.
Kalibrointinäyte
Vertailunäyte (esimerkiksi puhdistettu RNA solulinjasta tai kudoksesta), jota käytetään suhteellisessa kvantifiointissa kaikkien muiden näytteiden vertailuun geenin suhteellisen ekspressiotason määrittämiseksi.Kalibrointinäyte voi olla mikä tahansa näyte, mutta se on yleensä kontrolli (esimerkiksi käsittelemätön näyte tai näyte kokeen nolla-ajasta).

Positiiviset kontrollit
käytä kontrollireaktioitatunnetut määrät mallia.Positiivisia kontrolleja käytetään usein tarkistamaan, että alukesarja tai aluke-anturisarja toimii oikein ja että reaktio on asetettu oikein.

Ei mallinhallintaa (NTC)
Kontrollireaktio, joka sisältää kaikki tarvittavat monistusreaktion komponentit paitsi templaatin, joka yleensä korvataan vedellä.NTC:n avulla voidaan löytää reagenssikontaminaation tai vieraan DNA:n aiheuttama kontaminaatio, mikä varmistaa tunnistustietojen aitouden ja luotettavuuden.NTC-kontrollin vahvistuminen osoittaa kontaminaatiota.

Ei RT-ohjausta (NRT)
RNA:n erotusprosessi voi sisältää jäännösgenomista DNA:ta, joka on erittäin haitallista ja on tiedon laatuun vaikuttava syyllinen ja qPCR:n luonnollinen vihollinen, joten kokeita suunniteltaessa se tulee suunnitella vain vahvistamaan RNA-detektiota.On kaksi tapaa, toinen on suunnitella alukkeita intronien poikki, toinen on poistaa DNA kokonaan, kumpi on parempi, josta keskustellaan myöhemmin.NTR-kontrolli on taikapeili DNA-saasteen havaitsemiseen.Jos vahvistusta on, se tarkoittaa saastumista.

Standardit
Standardit ovat näytteitä, joiden konsentraatio tai kopiomäärä tunnetaan ja joita käytetään standardikäyrän muodostamiseen.Standardin stabiilisuuden varmistamiseksi geenifragmentti kloonataan tavallisesti plasmidiin ja sitä käytetään standardina.

Vakiokäyrä
laimennetaan yleensä vähintään viiteen pitoisuusgradienttiin standardituotteella kaksinkertaistussuhteen mukaisesti, ja CT-arvon ja kopioluvun koordinaatteihin piirretään 5 pistettä, ja pisteet yhdistetään muodostamaan viiva standardikäyrän luomiseksi.Jokaisen standardikäyrän kelpoisuus on tarkistettava.Kulmakertoimen arvo on välillä –3,3 ja –3,8, ja jokainen pitoisuus suoritetaan kolmena rinnakkaisena.Pisteet, jotka eroavat merkittävästi muista kohdista, tulee hylätä.Testattavan näytteen CT-arvo tuodaan standardikäyrään ja testattavan näytteen ilmentymistaso voidaan laskea.

Testattavan näytteen CT-arvo tuodaan standardikäyrään ja testattavan näytteen alkuperäinen kopioluku voidaan laskea.

Tehokkuus ja kaltevuus
Standardikäyrän kaltevuus edustaa reaaliaikaisen PCR:n tehokkuutta.
· Kaltevuus -3,322 osoittaa, että PCR-monistuksen tehokkuus on 1 tai 100 % tehokas ja PCR-tuotteen määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä.
·Alle –3,322 (esim. –3,8) kaltevuus osoittaa PCR-tehokkuuden
· Kulmakerroin, joka on suurempi kuin –3,322 (esim. –3,0), osoittaa, että PCR-tehokkuus näyttää olevan suurempi kuin 100 %, mikä on kummallista, kuinka yksi PCR-sykli voisi tuottaa yli kaksinkertaisen monistetun tuotteen?Tämä tilanne esiintyy PCR-reaktion epälineaarisessa vaiheessa, toisin sanoen on olemassa suuri määrä epäspesifistä monistumista.

sulamiskäyrä
Kun qPCR-monistus on valmis, PCR-tuote kuumennetaan.Lämpötilan noustessa kaksijuosteinen monistustuote sulaa vähitellen, mikä johtaa fluoresenssin intensiteetin laskuun.Kun tietty lämpötila (Tm) saavutetaan, suuri määrä tuotteita sulaa.Fluoresenssi laskee jyrkästi.Eri PCR-tuotteilla on erilaiset Tm-arvot ja erilaiset sulamislämpötilat, joten PCR:n spesifisyys voidaan tunnistaa.

Sulamiskäyrä (johdannaiskäyrä)
Sulamiskäyrä johdetaan huippukartan muodostamiseksi, joka voi näyttää intuitiivisemmin PCR-tuotefragmenttien tilanteen.Koska sulamislämpötila on DNA-fragmentin Tm-arvo, voidaan arvioida joitain parametreja, jotka vaikuttavat DNA-fragmentin Tm-arvoon, kuten fragmentin koko, GC-pitoisuus jne. Yleisesti ottaen alukkeen suunnitteluperiaatteidemme mukaisesti,monistetun tuotteen pituus on välillä 80-300 bp, joten sulamislämpötilan tulisi olla välillä 80°C - 90°C.

Sulamiskäyrän tulkinta: Jos ainoa pääpiikki näkyy välillä 80 °C - 90 °C, se tarkoittaa, että fluoresoiva kvantitatiivinen PCR on täydellinen;jos pääpiikki esiintyy välillä 80 °C - 90 °C ja sekalaiset piikit ilmaantuvat alle 80 °C, alukedimeeriä harkitaan periaatteessa.Voit yrittää nostaa hehkutuslämpötilaa ratkaistaksesi sen;jos pääpiikki ilmaantuu välillä 80°C - 90°C ja sekalainen piikki ilmaantuu uudelleen lämpötilan noustessa, katsotaan periaatteessa DNA-kontaminaatioksi ja DNA on poistettava kokeen alkuvaiheessa.

Tietysti on vielä joitain epänormaaleja tilanteita, jotka eritellään yksitellen alla.
3. Edistynyt tieto

Jotta voin tehdä qPCR:n, minun on sanottava MIQE,Vähimmäistiedotjulkaisua vartenMäärällinenReaaliaikainen PCRKokeet — vähimmäistiedot reaaliaikaista kvantitatiivista PCR:ää koskevien artikkeleiden julkaisemista vartenkokeita.Yksinkertaistamme keskeistä sisältöä, jotta kaikki ymmärtäisivät.

Voit etsiä MIQE:n alkuperäistä tekstiä Internetistä, ja tärkeintä on, että se sisältäätietojen tarkistuslista, joka on annettava artikkelia julkaistaessa .

Arvostelijat voivat arvioida kokeen laadun lukemalla nämä tiedot;Tulevat lukijat voivat myös käyttää tätä kokeilun toistamiseen tai parantamiseen.
On syytä huomata, että tässä luettelossa kunkin luettelon tärkeys on merkitty E:llä tai D:llä.Mitä se tarkoittaa?E: olennaiset tiedot (on toimitettava);D: toivottavaa tietoa (anna mahdollisimman paljon).

MIQE (1) – Kokeellinen suunnittelu
Monet jätkät, jotka ovat suorittaneet puolustuksensa valmistumisen jälkeen, eivät osaa suunnitella koetta itsenäisesti, avata vihkoaan ja tehdä mitä opettaja käskee.Tästä johtuen kokeellinen suunnittelu ei ollut tiukkaa, ja lehden toimitus sanoi, että he halusivat keksiä tämän kuvan ja sen kuvan, joten he tekivät sen hämmentyneenä.Näin jätkät tehdään!

Lähempänä kotia, kokeilun ensimmäinen periaate on määrittääkokeellisen logiikan ankaruus.Kaikkein perustavanlaatuisin asia on kokeellinen suunnittelu, ja tärkeintä kokeen suunnittelussa on se, miten kohdenäyte, vertailunäyte (vertailu) ja toistojen määrä asetetaan niin, että kokeelliset tiedot ovat vertailukelpoisia, vertailukelpoisia ja vakuuttavia.

Kohdenäytetarkoittaa näytettä, joka vaatii meitä havaitsemaan kohdegeenin tietyn hoidon jälkeen.Viitenäyteon näyte ilman mitään käsittelyä, jota biologiassa usein kutsutaan villityypiksi.

Kokeelliset kopiotovat erittäin tärkeitä.Yleensä vakuuttavien kopioiden lukumäärän on oltava enemmän kuin kolme.On tarpeen erottaa, mikä on biologista replikaatiota ja mikä teknistä replikaatiota.

Biologiset kopiot: Sama varmistuskoe tehty eri materiaaleilla (aika, kasvit, erät, reaktiolevyt).

Biologinen päällekkäisyys
Otetaanpa esimerkkinä pippurin torjunta-ainekäsittely.Haluamme ruiskuttaa torjunta-aineita kolmeen ABC:n kasviin, sitten ABC:n kolme kasvia ovat kolme biologista kopiota, ja ne ovat sama varmennuskoe, joka on tehty eri materiaaleilla.Mutta kokeena tarvitaan ehdottomasti kontrolli, joten voimme ruiskuttaa yhden kasvin A oksasta muodostaaksemme koeryhmän A-kasvin, eikä ruiskuttaa muita kasvin A oksia muodostaaksemme kontrolliryhmän.Tee sama B:lle ja C:lle.

Tekniset kopiot (tekniset kopiot): Se on toistuva koe, joka on suunniteltu välttämään toiminnan aiheuttamia virheitä, mikä on itse asiassa samassa materiaalissa oleva kaksoisreikä.Sekä hoidoissa että kontrolleissa on oltava kohdegeenin ja sisäisen vertailugeenin toistoasetukset (vähintään kolme).

Tekninen toisto
Otetaan taas torjunta-aineilla käsitelty paprika esimerkkinä.Kasvin A koeryhmälle teimme kolme PCR-reikää 1, 2 ja 3 sen kohdegeenille ja vastaavasti sisäiselle vertailugeenille, jotta saimme keskiarvon havaitsemisen jälkeen.A-laitoksen valvonnassa ryhmiä käsitellään myös samalla tavalla.Suorita sama käsittely B- ja C-kasveille.Tämä on teknistä toistoa.

Se kannattaa huomioidaTilastoon tulee biologinen toisto, ja tekninen toisto on testata, onko kokeellisessa prosessissa satunnaisia ​​ilmiöitä, jotta koetuloksista tulee uskottavia, eli vältytään virheiltä ottamalla niiden keskiarvo, kuten usein sanotaan.

Negatiiviset kontrollit – NTC ja NRT
NTC (ei mallia ohjaus), kontrollia ilman mallia, käytetään tarkistamaan, onko koemateriaali kontaminoitunut.Yleensä vettä käytetään mallina.Jos fluoresoiva reaktio tapahtuu, se tarkoittaa, että laboratoriossa on tapahtunut nukleiinihappokontaminaatiota.

Nämä saasteet ovat peräisin: epäpuhdas vesi, pätemättömät reagenssit, jotka sisältävät endogeenistä DNA:ta, alukkeiden saastuminen, laboratoriolaitteiden saastuminen, aerosolisaaste jne., on käytettävä RNaasi-puhdistimia ja RNaasi-inhibiittoreita.Aerosolipäästöjä on vaikein löytää.Kuvittele, että laboratoriosi on kuin savusumua, jossa on erilaisia ​​nukleiinihappoja ilmassa.

NRT (ei käänteiskopioijaa), kontrolli ilman käänteistranskriptiota, on ei-käänteiskopioitunut RNA negatiivisena kontrollina, joka on gDNA-tähteen kontrolli.

Geeniekspressiota tehtäessä RNA:n määrä havaitaan havaitsemalla cDNA:n määrä käänteistranskription jälkeen.Jos RNA:ta puhdistettaessa on gDNA-jäännöstä, se aiheuttaa virheitä koetuloksissa, koska varsinaiset tulokset ovat gDNA ja cDNA.Aggregaattitasolla, ei vain cDNA:ta, gDNA on poistettava kokonaan RNA:n uuttamisen aikana.

MIQE (2) – esimerkkitiedot
Ns. näytetieto tarkoittaa, että kun julkaisemme artikkelin qPCR:stä, meidän on selitettävä näytetiedot selkeästi, mikä on olennainen osa artikkelia.Vastaavasti näytteitä käsitellessämme on myös säädettävä omaa toimintaamme näytteiden oikeellisuuden varmistamiseksi.

Näytteen kuvaus on vain tulos, ja meidän tulisi kiinnittää enemmän huomiota koko kokeen aikana otettuihin materiaaleihin.

Kokeellisten materiaalien valinta
Verinäytteet – valitse tuore veri, enintään 4 tuntia.Solunäytteet – valitse kerätäksesi tuoreita soluja voimakkaan kasvun aikana.Eläinkudos – Valitse tuore, voimakkaasti kasvava kudos.Kasvikudos – Valitse tuore, nuori kudos.

Olet varmasti huomannut, että näissä muutamassa lauseessa on avainsana: tuore .
Yllä oleville näytteille markkinoiden paras, kustannustehokkain ja vakaa pakkaus on Foregenen pakkaus, joka voi nopeasti ja helposti erottaa niiden DNA:n ja RNA:n.

Veren DNA:n minisarja

Cell Total RNA Isolation Kit

Animal Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Kasvien DNA:n eristyspakkaus

Kokeellisten materiaalien varastointi
Yleisesti ottaen emme suosittele näytteiden säilyttämistä, jos olosuhteet sen sallivat.On kuitenkin monia ystäviä, jotka eivät voi tehdä kokeita heti näytteenoton jälkeen, ja joidenkin on jopa kannettava nestetyppisäiliöitä pellolle näytteenottoa varten.

Tällaiselle ahkeralle ystävälle voin vain sanoa, ettet ymmärrä reagenssien kulutusosia.Nyt monet reagenssikulutusyritykset tuottavat reagensseja, jotka voivat säilyttää RNA-näytteitä huoneenlämmössä, ja voit halutessasi käyttää niitä.Perinteinen varastointitapa on nestemäisen typen varastointi, jossa käytetään pientä nestetyppisäiliötä, jota on helppo kuljettaa mukana.Kun näyte on tuotu takaisin laboratorioon, säilytä se -80°C jääkaapissa.

RNA:ta koskevissa kokeissa on noudatettava kuuden sanan periaatetta:matala lämpötila, ei entsyymejä,janopeasti .

Matalan lämpötilan käsite on helppo ymmärtää;ilman entsyymejä RNaasi on kaikkialla maailmassa, jossa elämme (muuten olisit tappanut HIV:n), joten kuinka välttää RNaasi kokeita tehdessä, on erittäin tärkeä käsite;nopeasti,Maailmassa ei ole Kung Fua, jota ei voi rikkoa, vain nopeutta ei voida rikkoa.

Siksi tietyssä mielessä mitä lyhyempi uuttoaika, sitä parempi sarja.Miksi tekeeForegene's kit korostaa nopeutta, koska he tietävät sen hyvin.

PS: Jotkut tytöt tekevät kokeita erittäin huolellisesti, mutta ne eivät ole yhtä hyviä kuin slam dunk usean vuoden työn jälkeen.He kokevat, että Jumala on epäoikeudenmukainen, valittavat muista ja etsivät elämää.Itse asiassa hän ei ymmärtänyt sitä.Hän ei suojannut RNA:ta hyvin, ja slam dunk -soitin oli ketterä.Kun hän teki kokeilua, hän ajatteli, että hän lopettaisi slam dunkin kolmella, viidellä ja kahdella jaolla, mutta hän teki kokeen hyvin.

Huomautus: Hitaampi, enemmän RNaasi-invaasion mahdollisuuksia.Kuinka kouluttaa itsesi nopeaksi?Ei ole mitään keinoa, harjoittele vain lisää.

Erilaisia ​​kokeita ja erilaisia ​​näytteitä varten on silti tarpeen lukea lisää kirjallisuutta ja valita sopiva käsittelymenetelmä.MIQE edellyttää näytteiden keräys- ja säilytysprosessia varten, että se on kirjoitettava paperiin selkeästi, jotta arvioijat voivat arvioida paperin luotettavuuden, ja myös hämmästyneiden nuorten on kätevä toistaa kokeilusi.

Vaikka biologiset kokeet ovat vaikeita, ne ovat huippuluokkaa.Jos et ole varovainen, voit kaataa maailman.Esimerkiksi SARS:n tekeminen biokemialliseksi kriisiksi tai hybridiriisin valmistaminen 1,3 miljardin ihmisen pelastamiseksi.Alla oleva kuva on kemiallinen koe, sinun pitäisi ymmärtää, kuinka ylpeä olet tutkimuksestasi jo katsomalla hänen munaa muistuttavaa ulkonäköään.Unohda se, älä mustamaa häntä.

MIQE (3) – nukleiinihappouutto.
Nukleiinihapon uuttaminen on iso tapahtuma, ja kaikki molekyylibiologiset kokeet alkavat nukleiinihapon uuttamisella.Ensinnäkin kopioidaan MIQE:n sisältö nukleiinihappouutosta.

Tätä muotoa katsottuna et voi pysyä pinnalla.Muoto on dogma.Ollaksesi huippuoppilas, sinun on kysyttävä miksi.Tämän taulukon olennainen sisältö on: JatkaRNA:n puhtaus, eheys, konsistenssi ja uuttomäärä .

Ensimmäinen osaprosessi tai instrumentti on nukleiinihapon uuttovaihe.Jos käytät uuttamiseen automaattista nukleiinihappopoistajaa (edennyt, ota minuun yhteyttä ostoa varten), sinun on ilmoitettava laitteen mallinimi.

Sarjan nimi ja

mitä pakkausta käytettiin muutoksen yksityiskohtiin, mitä erikoisreagensseja lisättiin tai mitä erikoistoimenpiteitä tehtiin, tulee selittää selkeästi, jotta muut voivat helposti toistaa kokeilusi.

Jotkut ihmiset lisäävät erityisiä reagensseja ottaessaan erikoisnäytteitä, koska ajattelevat, että tämä on heidän salainen asensa, eivätkä kerro muille.Vaikka he pitävät sen salassa, he menettävät myös mahdollisuuden saada artikkelisi loistaa.Älä ole nokkela, sinun on oltava rehellisempi kuin maan vanha Zhang tieteellisessä tutkimuksessa, jos haluat olla fiksu, artikkeli tekee sinusta tyhmän.

täytyy muistaa sarjan tuotenumerokun tilaat sarjan ja kirjoitat artikkelin.Sarjassa on yleensä kaksi numeroa: Cat – luettelonumero (tuotenumero, artikkelinumero), erä – tuoteerän numero ( käytetään osoittamaan, mistä erästä tuote on peräisin).

Lisäksi CAS-numeroa käytetään usein tilattaessa biokemiallisia reagensseja ja popularisoin sitä yhdessä.CAS-numero on American Chemical Societyn jokaiselle uudelle kemialliselle lääkkeelle antama numero.Yleensä kolme numeroa on yhdistetty katkoviivalla.Rushuin CAS-numero: 7732-18-5.Kemikaalilla on usein useita aliaksia, mutta CAS-numero on ainutlaatuinen.Kun tilaat lääkkeen, voit tarkistaa ensin sen CAS-numeron.

Lähempänä kotia, miksi meidän täytyy kuvata nämä asiat selkeästi?Itse asiassa se on myös RNA:n uuton laadun tarkistaminen.Instrumenttien ja sarjojen käyttö tekee RNA:n erottamisesta johdonmukaisemman.Tavallisten laboratorioiden uuttomittakaava ei ole suuri, ja se voidaan saada sarjoilla.

Yksityiskohdat DNaasi- tai RNaasi-hoidosta
Fluoresoivan kvantitatiivisen PCR:n tärkeä kysymys on estää DNA:n kontaminaatio, äläkä kokeile, jos kontaminaatiota on.Siksi on välttämätöntä ilmoittaa prosessi, jota käytit DNA:n käsittelyyn, jotta voidaan osoittaa, että kokeellisessa prosessissa oleva DNA on poistettu kokonaan ja kokonaan.esitetty kaaviolla.

Kaaviokaavio RNA:sta ja DNA:sta
Yleensä menetelmä DNA:n poistamiseksi on käsitellä RNA:ta DNaasilla uuttamisen jälkeen.Nämä ovat kuitenkin suhteellisen vanhoja menetelmiä.Kaupalliset RNA:n uuttosarjat ovat pystyneet poistamaan DNA:ta uuttamisprosessin aikana lisäämättä DNaasia.Esimerkiksi sarja Foregenen sarjoja.

Huomautus: DNA:n poistaminen RNA:n erottamisen aikana on erittäin vaarallinen kaksiteräinen miekka, joka pidentää RNA:n uuttamisen toiminta-aikaa ja lisää RNA:n hajoamisen riskiä.Pohjimmiltaan se on kompromissi RNA:n saannon ja puhtauden välillä.

Lisäksi piidioksidipohjaiseen adsorptiokolonniin lisättävän DNaasin määrä on hyvin pieni, ja vaikutuksen saavuttamiseksi on käytettävä korkealaatuista DNaasia.Optimoimatonta DNA:sta ei voida pilkkoa nopeasti ja täydellisesti.Tämä on kauppiaan teknisen tason testi.Tietenkin on vieläkin oudompia kauppiaita, jotka ylpeilevät siitä, että DNA voidaan poistaa ilman DNaasi.Voidaan sanoa, että jokainen, joka kerskuu, että DNA voidaan poistaa kokonaan ilman DNaasia, on huligaani.DNA on suhteellisen vakaa kaksijuosteinen rakenne, eikä sitä voi pyyhkiä pois pelkästään puhumalla ja nauramalla.

Saastumisen arviointi
arviointimenetelmä: elektroforeesitunnistus, 1 % agaroosi, 6 V/cm, 15 min, lataus 1-3 ul

Nukleiinihappojen kvantitatiivinen analyysi
mitataan yleensä UV-spektrofotometrillä.Haluan ensin tehdä suosituksi kolmen arvon OD260, OD280 ja OD230 merkityksen.
·OD260nm: Se on nukleiinihapon korkeimman absorptiohuipun absorptioaallonpituus, ja paras mitattu arvo vaihtelee välillä 0,1-1,0.Jos näin ei ole, laimenna tai väkevöi näyte, jotta se pysyy alueella.
·OD280nm: Se on proteiinien ja fenolien aineiden korkeimman absorptiohuipun absorptioaallonpituus.
·OD230nm: Se on hiilihydraattien korkeimman absorptiohuipun absorptioaallonpituus.

Seuraavaksi puhutaan kunkin indikaattorin roolista.A260:lle sitä voidaan käyttää nukleiinihapon saannon mittaamiseen.Kun OD260 = 1, dsDNA = 50 μg/ml, ssDNA = 37 μg/ml, RNA = 40 μg/ml.

Puhtauden vuoksi meidän on tarkasteltava suhteita, joita näemme yleisesti: OD260/280 ja OD260/230.
·Puhdas DNA: OD260/280 on suunnilleen yhtä suuri kuin 1,8.Kun se on suurempi kuin 1,9, se osoittaa, että on olemassa RNA-saastetta, ja kun se on pienempi kuin 1,6, se osoittaa, että on olemassa proteiini- ja fenolisaaste.
·Puhdas RNA: 1.7
·OD260/230: Olipa kyseessä DNA tai RNA, viitearvo on 2,5.Kun se on alle 2,0, se tarkoittaa sokerin, suolan ja orgaanisen aineksen saastumista.

RNA:n eheys

On erittäin tärkeää mitata RNA:n eheys.Yleensä on tarpeen tehdä RNA:n denaturaatiogeelikoe sen tarkistamiseksi, onko 28S- ja 18S-RNA:n välinen kirkkaus kaksinkertainen.Kun kolmas vyöhyke 5S ilmestyy, se tarkoittaa, että RNA on alkanut hajota, paitsi selkärangattomissa.

Tiedot RNA-laadun arviointiin: Yllä olevien testien lisäksi on olemassa myös RNA:n eheyden kannalta edistyneempiä instrumenttitestejä, kuten Experion-automaattisen elektroforeesijärjestelmän RQI-eheystesti, joka pystyy havaitsemaan, onko RNA hajotettu näkymättömästi.

Tieteellisessä tutkimuksessa fluoresoiva kvantitatiivinen PCR on kohdegeenin ja sisäisen vertailugeenin vertailu.Siksi RNA-näytteen säilytysprosessissa, RNA-uutossa jne. ensisijaisena tavoitteena on varmistaa RNA:n eheys.

Kuinka RNA:n eheys vaikuttaa kohdegeenin ja sisäisen vertailugeenin väliseen tasapainoon, voidaan helposti ymmärtää alla olevasta kuvasta.Hajoaminen johtaa geenin epätäydellisyyteen, oli kyseessä sitten sisäisen vertailugeenin epätäydellisyys tai kohdegeenin epätäydellisyys, sillä on suuri vaikutus tietoihin.

Kohdegeenin ja vertailugeenin kaavio ei saa olla totta

Estotesti (vaimeneeko CT-arvo korkeassa tai pienessä pitoisuudessa tai muissa olosuhteissa)

Esimerkkinä tästä kuvasta viiden käyrän Ct-arvot ovat seuraavat.CT-arvojen jakautuminen käyrien välillä on epätasainen, ja Ct-arvot viivästyvät korkeissa ja matalissa pitoisuuksissa, mikä on PCR-eston tapauksessa.

Keskeinen kohta: RNA:n uuttamisprosessissa meidän on hylättävä väärinkäsitykset ja luotava oikeat.

Väärä ajatus on: RNA:n uuttaminen tavoittelee vain tuottoa, ajatellen, että mitä suurempi määrä RNA:ta saadaan, sitä parempi.Itse asiassa, kun teemme kvantifioinnin, jos geenien määrä ei ole kovin suuri, emme tarvitse paljon RNA:ta.Poimimasi RNA:n määrä on enemmän kuin tarpeeksi.

Oikea käsite on:RNA:n uuttamisen tulisi pyrkiä puhtauteen, eheyteen ja johdonmukaisuuteen.Puhtaus voi varmistaa, että myöhempi käänteistranskriptio ei estä ja DNA ei vaikuta tietoihin.Eheys varmistaa kohdesekvenssien ja sisäisten viitteiden tasapainon.Johdonmukaisuus varmistaa vakaan näytteen lataamisen.

MIQE (4) – käänteinen transkriptio
Väärinkäsitys: pyrkimys suurempaan näytemäärään.
Oikea käsite: Pyri johdonmukaisuuteen (stabiilisuuteen), ladatun RNA:n määrästä riippumatta, käänteistranskription tehokkuus pysyy yhtenäisenä varmistaen, että cDNA:n erot voivat todella heijastaa mRNA:n eroja.
Selitämme tämän prosessin kaaviolla:

Kaaviokaavio käänteistranskription tehokkuudesta, eivät pidä paikkaansa
Ensinnäkin meidän on ymmärrettävä ero käänteistranskriptioprosessin ja PCR-prosessin välillä.PCR käy läpi useita kuumennus- ja pariutumisprosesseja, ja kohdefragmentti kasvaa eksponentiaalisesti;vaikka käänteistranskriptiossa ei ole tätä prosessia, voimme kuvitella, että käänteistranskriptio on itse asiassa yksi-yhteen Replikaatioprosessin aikana niin monta RNA-palaa

koska cDNA-informaatiota on mahdollista saada niin monta kappaletta, se pitäisi jo nyt ymmärtää, koska isot ja pienet fragmentit on käänteistranskriptoitu ja yhteen fragmenttiin on mahdotonta keskittyä.Ja koska RNA:n määrä on suhteellisen pieni, myös saadun cDNA:n määrä on suhteellisen pieni, toisin kuin PCR:llä, jolla on monistusvaikutus, joten sen havaitseminen on periaatteessa mahdotonta.

cDNA-elektroforeesitulokset
Toiseksi, ihannetapauksessa käänteinen transkriptio suoritetaan yksitellen, mutta yksikään yritys ei voi saavuttaa tätä vaikutusta.Periaatteessa useimpien käänteiskopioijaentsyymien tehokkuus vaihtelee 30-50 prosentin välillä.Jos näin on, haluaisimme mieluummin suhteellisen vakaan käänteistranskription tehokkuuden, minkä haluamme nähdä kuvassa: 3 RNA:ta saa 2 cDNA:ta, 6 RNA:ta 4 cDNA:ta, joten riippumatta siitä, kuinka paljon näytettä ladataan, käänteistranskription tehokkuus on suhteellisen vakaa.Emme halua nähdä tilannetta, jossa käänteistranskription tehokkuus on epävakaa ja korkea pitoisuus estyy.

Joten kuinka tarkistaa, onko käänteisen transkription tehokkuus vakaa?Menetelmä on hyvin yksinkertainen, sinun tarvitsee tehdä vain vertailutesti: yksi on käänteiskopiointi cDNA:ksi RNA:n kaksinkertaisen laimentamisen jälkeen ja toinen on tehdä kaksinkertainen laimennus cDNA:ksi käänteisen transkription jälkeen ja tehdä sitten qPCR nähdäksesi saatu kulmakerroin Onko se johdonmukainen.Huippuopiskelijana sinun pitäisi ymmärtää se sekunneissa.Kuten alla:

RNA:n ja cDNA:n laimennus sen testaamiseksi, onko käänteistranskription tehokkuus stabiili
Käänteinen transkriptaasi ja pakkaus
Kuinka täydellisellä fluoresoivalla kvantitatiivisella PCR:llä voi olla erinomainen käänteiskopioija ja pakkaus.Käänteistranskriptaasi jaetaan karkeasti kahteen tyyppiin lähteen mukaan, AMV taiM-MLV, ja niiden suorituskyky on sama kuin taulukossa.

RNaasi H -aktiivisuus
RNaasi H on ribonukleaasi H, kiinalainen nimi on ribonukleaasi H, joka on endoribonukleaasi, joka voi spesifisesti hydrolysoida RNA:ta DNA-RNA-hybridiketjussa.RNaasi H ei voi hydrolysoida fosfodiesterisidoksia yksijuosteisessa tai kaksijuosteisessa DNA:ssa tai RNA:ssa, eli se ei pysty pilkkomaan yksijuosteista tai kaksijuosteista DNA:ta tai RNA:ta.Käytetään yleisesti cDNA:n toisen juosteen synteesissä.

Se on outo asia.Sanomme, että käänteiskopioijaentsyymillä on RNaasi H -aktiivisuutta, ei sitä, että käänteiskopioijaentsyymi sisältää RNaasi H:ta, ja RNaasi H:ta ei ehkä ole mahdollista erottaa käänteiskopioijakopiosta, ehkä johtuen tiettyjen ryhmien konformaatiosta käänteiskopioijaentsyymissä. Tämä aktiivisuus johtuu käänteiskopioijaentsyymistä.

Siksi riippumatta AMV:n korkeammasta käänteistranskription tehokkuudesta sen RNaasi H -aktiivisuus vähentää cDNA:n saantoa.Tietenkin reagenssien valmistajat optimoivat jatkuvasti tuotteitaan eliminoidakseen RNaasi H -aktiivisuuden käänteiskopioijaentsyymistä niin paljon kuin mahdollista lisätäkseen cDNA:n saantoa.
Hehkutuslämpötila

RNA:n toissijainen rakenne eri lämpötiloissa
Katso yllä olevasta kuvasta RNA:n sekundaarirakenne eri lämpötiloissa ja käytä mFold-verkkotyökalua kohdefragmentin sekundaarisen rakenteen määrittämiseen tietyissä lämpötila- ja suolapitoisuuksissa.55 °C:ssa RNA:n sekundaarirakenne on edelleen hyvin monimutkainen, käänteiskopioija ei voi toimia, ja sekundaarirakennetta ei voida täysin erottaa ennen kuin lämpötila on 65 °C, kun taas AMV:n ja M-MLV:n optimilämpötila on paljon tätä lämpötilaa alhaisempi.
mitä tehdä?Toissijainen rakenne on itse templaatin komplementaarinen pariliitos, mikä johtaa vahvaan kilpailuun alukkeen ja käänteistranskriptaasin ja templaatin välillä, mikä johtaa sarjaan ongelmia, kuten alhainen E ja huono toistettavuus.

mitä tehdä?Nosta hehkutuslämpötilaa vain niin paljon kuin mahdollista.

Monet reagenssien valmistajat parantavat käänteistranskriptaasiaan geenitekniikan avulla.Jotkut lisäävät reaktiolämpötilaa, kuten Jifan ja Aidelai, ja jotkut poistavat RNaasi H -entsyymin aktiivisen ryhmän parantaakseen entsyymin ja RNA-templaatin välistä affiniteettia.Korkea affiniteetti voi puristaa kilpailevasti pois toissijaisen rakenteen ja lukea läpi sujuvasti, ja myös parantaa huomattavasti käänteistranskription tehokkuutta.
Keskeinen kohta: Käänteistranskriptio on tärkeämpää pyrittäessä käänteistranskription tehokkuuden johdonmukaisuuteen (entsyymien tulee olla paitsi tehokkaita myös stabiileja) kuin ladatun näytteen määrä, jos kyseessä ei ole erityisen laajamittainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR, se ei ole ollenkaan mahdollista.Useita cDNA:ita.
Myös useat valmistajat ovat ponnistellut johdonmukaisuuden saavuttamiseksi.Esimerkiksi useimmat yritykset ovat nyt pakkaaneet käänteisen transkription vakiopakkaukseksi myyntiin, mikä on hyvä valinta.
Esimerkiksi Foregenen RT Easy Series -sarjat:

RT Easy I (pääesisekoitus ensimmäisen juosteen cDNA-synteesisarjalle)

MIQE (5) – kohdegeenitieto

Yllä oleva kuva selittää
1. Se, onko tämä geeni tehokas toistuviin kokeisiin, voidaan yleensä varmistaa toistuvilla kokeilla.
2. Geenitunnus, tiedäthän.
3. Geenin pituus, kohdegeenin kokonaispituus ei todellakaan ole ongelma.Kun suunnittelet alukkeita, varmista, että amplikonin pituus on 80-200 bp paremman vahvistustehokkuuden varmistamiseksi.
4. Sekvenssi Blast -vertailutiedot, kohdegeeniä on verrattava geenipankissa epäspesifisen monistumisen estämiseksi.
5. Pseudogeenien läsnäolo.Pseudogeeni on DNA-sekvenssi, joka on samanlainen kuin normaali geeni, mutta menettää normaalin toimintansa.Se esiintyy usein eukaryoottien monigeeniperheessä.Sitä edustaa yleensä ψ.Se on ei-toiminnallinen genominen DNA-kopio genomissa, joka on hyvin samanlainen kuin koodaava geenisekvenssi., joita ei yleensä kopioida, eikä niillä ole selkeää fysiologista merkitystä.
6. Alukkeiden sijainti suhteessa eksoneihin ja introniin.Alkuvuosina, kun ratkaisimme DNA-kontaminaation ongelman, kiinnitimme usein huomiota alukkeiden, eksonien ja intronien sijaintiin ja yleensä harkitsimme alukkeiden suunnittelua intronien poikki DNA:n monistumisen välttämiseksi.Katso alla oleva kuva: musta edustaa introneja, erilaiset siniset edustavat eksoneja, vaaleanpunainen edustaa tavallisia alukkeita ja kirkas punainen edustaa intronien ulottuvia alukkeita.

Kaavamainen, ei koskaan totta
Miltä täydelliseltä suunnitelmalta tämä näyttää, mutta itse asiassa, useimmissa tapauksissa trans-intronialukkeet eivät ole niin maagisia kuin kuvitellaan, ja ne aiheuttavat myös epäspesifistä vahvistusta.Joten paras tapa estää DNA-kontaminaatio on poistaa DNA kokonaan.
7. Konformaatioennuste.Käytä tätä esimerkkiä uudelleen ja käytä mFold-verkkotyökalua määrittääksesi kohdefragmentin sekundaarisen rakenteen tietyssä lämpötilassa ja suolapitoisuudessa.

RNA:n toissijainen rakenne eri lämpötiloissa
Toissijainen rakenne on itse templaatin komplementaarinen pariliitos, mikä johtaa vahvaan kilpailuun alukkeen ja templaatin parin välillä, ja alukkeen sitoutumisen mahdollisuudet ovat pienemmät, mikä johtaa sarjaan ongelmia, kuten alhainen E ja huono toistettavuus.Ohjelmiston ennustamisen kautta, jos ei ole toissijaista rakenneongelmaa, se olisi hienoa.Jos on, jatkoartikkelissamme käsitellään erityisesti tämän ongelman ratkaisemista.

MIQE (6) - qPCR-oligonukleotidit

Fluoresoivassa kvantitatiivisessa PCR:ssä ensimmäinen asia, jonka kanssa kamppailet joka päivä, on RNA:n uuttaminen, ja toinen asia voi olla alukkeen suunnittelu.
Ensinnäkin tarkistamme edelleen pohjamaalien suunnittelun säännöt MIQE-tarkistuslistan mukaan.Se on niin yksinkertaista, että ropparit voivat nauraa, ja voimme lopettaa sen yhdellä lauseella: selvitä alukeanturin järjestys ja sijainti sekä modifiointimenetelmä.Alukkeen puhdistusmenetelmässä alukkeen synteesi on tällä hetkellä niin halpaa, qPCR on PAGE:n ja sitä korkeampien puhdistusmenetelmien arvoinen, eikä synteesilaitteen tiedot ole tärkeitä.Monet ihmiset ovat tehneet alukkeita vuosikymmeniä eivätkä tiedä, että syntetisaattori on ABI3900.
Mitä tulee pohjustussuunnittelun periaatteisiin, niitä ei tarvitse opetella ulkoa, sillä useimmat primer-suunnitteluohjelmistot tai online-työkalut voivat hoitaa nämä ongelmat (suositeltava verkkotyökalu primer3.ut.ee/), ja 99,999% pohjamaalien suunnittelusta ei tehdä manuaalisesti.
Tarkista vain seuraavat kohdat pohjamaalien suunnittelun jälkeen:
1. Suunnittele alukkeet lähellä 3'-päätä: Jos cDNA:n ensimmäisen juosteen synteesiin käytetään oligo-dT-alukkeita, suunnitellut alukkeet on suunniteltava käänteistranskription tehokkuuden ja RNA:n eheyden huomioon ottaen lähelle 3'-päätä monistustehokkuuden parantamiseksi.Käytä kuvaa selittääksesi seuraavaa (tätä ei voi ymmärtää):

Miksi alukkeet pitäisi suunnitella lähelle 3′-päätä, se ei saa olla totta
2. TM-arvo: Tm-arvo on 55-65 °C (koska eksonukleaasiaktiivisuus on korkein 60 °C:ssa) ja GC-pitoisuus on 40-60 %.
3. BLAST: Genomin epäspesifisen monistumisen välttämiseksi Blastia on käytettävä lisävarmentamiseen.

MIQE(7) – qPCR-prosessi

1. qPCR-sarja
MIQE:n vaatimusten mukaisesti meidän on kuvattava artikkelissa selkeästi täydelliset reaktio-olosuhteet, mukaan lukien PCR-reaktiojärjestelmän kokoonpano, mitä sarjaa käytetään, kuka on valmistaja, kuinka suuri reaktiojärjestelmä on, käytetäänkö värimenetelmää vai koetinmenetelmää, PCR-ohjelman asetukset.Veteraanikuljettajat huomaavat varmasti, että niin kauan kuin sarja on valittu, yllä olevat tiedot ovat periaatteessa määritettyjä.
Tällä hetkellä fluoresoivien kvantitatiivisten PCR-pakkausten valmistus ja tuotanto on erittäin kypsää tekniikkaa.Niin kauan kuin et valitse erittäin huonoja valmistajia, ongelmien todennäköisyys ei ole suuri, mutta haluamme silti jakaa kanssasi muutaman seikan:
Hot-start Taq-entsyymi:PCR:n tärkein osa on kuumakäynnistys Taq-entsyymi.Markkinoilla olevat kuumakäynnistysentsyymit jaetaan yleensä kahteen tyyppiin, joista toinen on kemiallisesti modifioitu kuumakäynnistysentsyymi (voit kuvitella sen parafiinin upotuksena), ja toinen on kuumakäynnistysentsyymi vasta-aineiden modifiointiin (antigeeni-vasta-ainesitoutuminen).Kemiallinen modifiointi on varhainen tapa kuumakäynnistää entsyymejä.Kun tietty lämpötila saavutetaan, entsyymi vapauttaa aktiivisuutensa.Vasta-ainemodifioitu kuumakäynnistysentsyymi käyttää biologisia menetelmiä estääkseen entsyymin toiminnan.Kun tietty lämpötila saavutetaan, vasta-aine denaturoituu ja inaktivoituu proteiinina, ja entsyymitoiminta otetaan käyttöön.

Mutta mitä hyötyä tästä on?Näin on, vasta-ainemodifioitujen entsyymien vapautumisaktiivisuus on nopeampaa kuin kemiallisesti modifioitujen entsyymien, joten herkkyyden suhteen vasta-ainemodifioiduilla entsyymeillä on pieni etu, joten kemiallisesti muunneltuja entsyymejä ei käytännössä ole markkinoilla olevissa kitteissä.Jos on, niin tämän valmistajan tekniikka on edelleen jumissa vuosituhannen aikakaudella.
Magnesiumionipitoisuus:Magnesiumionikonsentraatio on erittäin tärkeä PCR-reaktiossa.Sopiva magnesiumionipitoisuus voi edistää Taq-entsyymiaktiivisuuden vapautumista.Jos pitoisuus on liian alhainen, entsyymiaktiivisuus vähenee merkittävästi;jos pitoisuus on liian korkea, entsyymien katalysoima epäspesifinen monistuminen tehostuu.Magnesiumi-ionien pitoisuus vaikuttaa myös alukkeiden pariutumiseen, templaatin ja PCR-tuotteiden sulamislämpötilaan, mikä vaikuttaa monistettujen fragmenttien saantoon.Magnesiumi-ionien konsentraatiota säädetään yleensä arvoon 25 mM.Tietysti hyvää sarjaa varten magnesium-ionien pitoisuus on oltava hyvin hallinnassa.Jotkut kauppiaat lisäävät reagenssiin magnesium-ioneja kelatoivaa ainetta, joka voi saavuttaa magnesiumionipitoisuuden automaattisen säädön vaikutuksen.
Fluoresoivan väriaineen pitoisuus:Fluoresoiva väriaine, joka on tavallisesti käyttämämme SYBR Green, tuottaa fluoresenssia pääasiassa sitoutumalla kaksijuosteisen DNA:n pienempään uraan, koska väriaineen sitoutuminen kaksijuosteiseen DNA:han on epäspesifistä, eli niin kauan kuin siihen yhdistetään kaksijuosteista DNA:ta, voi tapahtua fluoresenssia, jolloin systeemin taustalla muodostuu aluke-templateereja.
PS: Valoherkkien ominaisuuksiensa vuoksi markkinoilla olevat tuotteet pakataan yleensä ruskeisiin läpinäkymättömiin sentrifugiputkiin (kuten alla olevasta kuvasta näkyy).Tämä tulee kuitenkin kohtaamaan ongelman.On vaikea nähdä, onko neste imetty näytteenoton aikana.Tässä suhteessa Qingke on todellakin käyttäjäystävällisin (kuten alla olevasta kuvasta näkyy), ja läpinäkyvä putki on pakattu läpinäkymättömään peltipussiin.Laita se sitten peltipussiin ottaen huomioon valon ja näytteenoton välttämisen mukavuus.Sinun on valittava oikea tuotenumero.TSE204 on erittäin kustannustehokas olemassaolo, jonka vuoksi haluan istuttaa nurmikon.

Fluoresoivan väriaineen pitoisuus on myös erittäin tärkeä.Jos pitoisuus on liian alhainen, vahvistuskäyrä ei nouse myöhemmässä vaiheessa eikä ole täydellinen;jos pitoisuus on liian korkea, se aiheuttaa häiriöitä.Koska fluoresoiva kvantitatiivinen PCR riippuu pääasiassa CT-arvosta, jos fluoresoivan väriaineen pitoisuutta ei säädetä kunnolla, alhainen kohta on parempi kuin huippupiste.Tietenkin sopiva väriainepitoisuus on paras.

ROX: ROX-värejä käytetään korjaamaan fluoresenssisignaalivirheitä.Jotkut laitevalmistajat vaativat kalibrointia, kun taas toiset eivät.Esimerkiksi Thermo Fisher Scientificin reaaliaikaisen PCR-amplifikaatiolaitteen käyttö vaatii yleensä kalibroinnin, mukaan lukien 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus jne. Yleiset pakkauksen ohjeet kuvaavat sen.
Foregenen qPCR Mix sisältää myös ROX-väriainetta, jota on kätevä käyttää eri malleissa.

Reaaliaikainen PCR Kit-Taqman

Heikko vetysidoskäsittely: Heikkojen vetysidosten käsittely on suhteellisen tekninen asia.Mikään ei ole lukenut monien sarjojen oppaita, mutta mikään niistä ei maininnut tätä aihetta.Itse asiassa se on niin tärkeää.Emästen yhdistelmä riippuu pääasiassa vetysidosten vahvuudesta.Vahvat vetysidokset ovat normaalia vahvistusta, ja heikot vetysidokset johtavat epäspesifiseen vahvistumiseen.Jos heikkoja vetysidoksia ei voida poistaa hyvin, ei epäspesifistä monistumista voida välttää.Kirjoittajan puitteissa vain harvat yritykset ovat huomanneet tämän ongelman.Kun ostat sarjan, voit viitata siihen, oletko harkinnut ratkaisua valitsemasi sarjan suhteen.

Reaktiotilavuus: 20-50ul järjestelmää käytetään yleisemmin, ja pienemmät tilavuudet aiheuttavat todennäköisesti virheitä.Yleisesti ottaen pakkauksen ohjeissa suositellaan PCR-reaktiotilavuuksien käyttöä.Älä ole älykäs ja käytä pienempiä määriä säästääksesi kustannuksia.tavoite.Kauppiaiden suosittelema volyymi on todellakin testattu, ja voi olla, etteivät he pysty ratkaisemaan pienten määrien aiheuttamaa virheongelmaa.
2. Putkilevyn valmistaja ja tuotenumero
Kaikki tietävät fluoresoivan kvantitatiivisen PCR:n periaatteen.Fluoresenssikeräys suoritetaan pääasiassa PCR-putkien korkkien kautta.Kun valitset PCR-tarvikkeita, kiinnitä huomiota kahteen seikkaan: hyvä valonläpäisy ja sopivuus instrumentille.Yleisesti ottaen valtavirran merkkien levyt ja putket ovat kunnossa, mutta sinun on valittava tarkkaan mukauttamisen suhteen, muuten et voi käyttää instrumenttia.

4. Huipputason tietämys

MIQE (8) – qPCR-validointi
Tämä on qPCR:n tärkein prioriteetti!Niin monet sankarit ovat pudonneet täällä hiekkaan.Tietysti on myös mahdollista, että olet onnekas ja tutkimasi geenit ovat yksinkertaisia, joten kelluit jääluolan läpi tuulta pitkin.qPCR:n varmennustiedot on tarkoitettu tietojen luotettavuuden testaamiseen.Luettelemme tarvittavat vahvistustiedot seuraavasti:

1.Spesifisyystesti
Kohdegeenin monistumisen spesifisyys testataan tarkistamalla, onko elektroforeesikuva yksi vyöhyke;sekvensoinnin vahvistus;sulamiskäyrä nähdäksesi, onko huippukartta yksittäinen;entsyymien pilkkomisen todentaminen ja muut menetelmät.
Tässä keskitymme tepäspesifisen monistumisen analyysi sulamiskäyrien menetelmällä.Yleisesti ottaen alukkeita suunniteltaessa tuotefragmentin koon vaaditaan olevan alueella 80-200 bp, mikä tekee PCR-tuotteen sulamislämpötilaksi 80-85 °C.Siksi, jos on erilaisia ​​piikkejä, täytyy olla muita epäspesifisiä vahvistustuotteita;jos piikki on alle 80 °C, sen katsotaan yleensä olevan alukedimeeri;jos huippu esiintyy yli 85 °C:ssa, sen katsotaan yleensä olevan DNA-kontaminaatio tai suurempien fragmenttien epäspesifinen monistuminen.
Huomautus: Joskus 80 °C:ssa on vain yksi huippu.Tällä hetkellä tätä käsitettä on noudatettava.On todennäköistä, että monistustulokset ovat kaikki alukedimeerejä.

Normaali sulamiskäyrä (yksi piikki ilman epäspesifistä vahvistusta)

Ongelmallinen sulamiskäyrä (epäspesifinen harhahuippujen vahvistus)
【Tapausanalyysi】

Päähuippu on, mutta alukkeen dimeeri on vakava
Alla olevan kuvan yksihuippuinen sulamiskäyrä voi helposti pettää silmäsi luullen sen olevan täydellinen kokeilu, mutta tulos on täysin väärä.Tällä hetkellä meidän on katsottava sulamislämpötilaa.Huippulämpötila on alle 80°C, mikä on täysin primer-dimeeriä.

Ei kohdefragmenttia, kaikki alukedimeerit
Tässä, veljeni ei voi lopettaa.Alla oleva kuva on matkapuhelimella otettu kuva, jonka roska on lähettänyt minulle.Kaikki hänen käyttämänsä reagenssit ovat alalla yleisesti käytettyjä merkkejä.Hän vaihtoi yhdestä T-etuliitebrändistä toiseen T-etuliitemerkkiin.Luulen, että olet jo arvannut sen.Roppari huusi minulle: "Ensimmäisessä kuvassa käytetty reagenssi on liian hyvä, ja piikki on yksittäinen.Myöhemmin, suosittelemasi reagenssin käytön jälkeen, siitä tulee toisen kuvan kaltainen, jossa on sekalaisia ​​piikkejä.Olet tehnyt minut onnelliseksi."
Erota kaksi kaaviota.Ensi silmäyksellä toisessa on yksi huippu ja toisessa kaksinkertainen huippu.Hölynpölyä, yksi huippu on tietysti hyvä.Onko se totta?
Pahempaa kuin Dou E, jos laitan kaksi kuvaa alla olevaan kuvaan, ymmärrät heti.Itse asiassa olemme helposti halvaantuneet tällaisesta kuvasta.Huolellisen analyysin jälkeen havaitsimme, että: ensimmäisen kuvan huippu on 75 °C:ssa, joka on täysin alukedimeeri;toisen luvun huippu näkyy 75°C:ssa ja 82°C:ssa, ainakin niitä on. Tuote näkyy.

Kuvia opiskelijoiden palautteesta
Perusongelma ei siis ole reagenssien ongelma, vaan alukkeen suunnittelun ongelma.Samalla se myös todistaa, että jotkut suuret merkit eivät ole rautalaatuisia, ja se todistaa myös sen, mitä veljeni sanoi aiemmin: Se ei ole reagenssimerkki, joka tue artikkeliasi.Se on artikkelisi, joka tuki reagenssien tuotemerkkiä.Kuvittele vain, jos roska ei vaihtaisi reagensseja, väärät tiedot lähetettäisiin päiväkirjaan, ja mitä tapahtuisi, olisi tragedia.
2. Nollakontrollin Ct-arvo
Älä selitä, jos tyhjällä kontrollilla on Ct-arvo, eikö se ole saastumista?Sinun on kuitenkin silti ymmärrettävä, millä tyhjällä ohjausobjektilla on Ct-arvo.Jos se on NTC, se tarkoittaa, että siinä on vieras DNA, kuten reagenssikontaminaatio.Jos se on NRT, se tarkoittaa, että uutetussa RNA:ssa on DNA-kontaminaatio.
3. Vakiokäyrä
Kaltevuus ja laskentakaava mukaan lukien PCR-tehokkuus voidaan laskea kaavan avulla.Täydellinen koe edellyttää, että standardikäyrän kaltevuus lähestyy arvoa 3,32 ja R² lähestyy arvoa 0,9999.
4. Lineaarinen dynaaminen alue
Reaktion dynaaminen alue on lineaarinen.Standardikäyrän luomiseen käytetyn mallin mukaan dynaamisen alueen tulee sisältää vähintään 5 pitoisuusgradienttia ja kiinnittää huomiota Ct-arvojen muutokseen korkeilla pitoisuusgradienteilla ja pienillä pitoisuusgradienteilla.
5. Havaitsemistarkkuus
Muutokset qPCR-tuloksissa, toisin sanoen huono toistettavuus, eli huono tarkkuus, johtuvat monista tekijöistä, mukaan lukien lämpötila, pitoisuus ja toiminta.qPCR-tarkkuudesta tulee yleensä vähemmän hallittavissa, kun kopiomäärä pienenee.Ihannetapauksessa kokeellisen vaihtelun tulisi olla erillään biologisesta vaihtelusta, ja biologiset replikaatiot voivat käsitellä suoraan qPCR-tulosten tilastollisia eroja ryhmien tai hoitojen välillä.Erityisesti diagnostisissa määrityksissä on raportoitava paras määritysten välinen tarkkuus (toistettavuus) paikkojen ja käyttäjien välillä.
6. Havaintotehokkuus ja LOD (multipleksisessa qPCR:ssä)
LOD on pienin havaittu pitoisuus 95 % positiivisista näytteistä.Toisin sanoen kohdegeenireplikaattien joukossa olevan LOD:n pitoisuus ei saisi ylittää 5 % epäonnistuneista reaktioista.Kun teet multipleksistä qPCR-analyysiä, erityisesti pistemutaatioiden tai polymorfismien samanaikaista havaitsemista varten, multipleksisen qPCR:n on todistettava, että useiden kohdefragmenttien tarkkuus ei vaarannu samassa putkessa, usean havainnoinnin ja yhden putken havaitsemisen tehokkuuden ja LOD:n tulee olla samat.Varsinkin kun samanaikaisesti monistetaan korkean pitoisuuden kohdegeenejä ja matalapitoisia kohdegeenejä, tähän ongelmaan on kiinnitettävä huomiota.
Ongelmia ja ratkaisujaYleisesti ottaen qPCR-virheenkorjauksessa usein kohtaamat ongelmat keskittyvät seuraaviin näkökohtiin:
·epäspesifinen vahvistus
·Alukekonsentraation vaikea valinta ja ongelmia primer-dimeerien kanssa
·Hehkutuslämpötila on epätarkka
·Toissijainen rakenne vaikuttaa vahvistuksen tehokkuuteen
epäspesifinen vahvistus
epäspesifinen vahvistustapahtuu , yleensä pohditaan, onko pohjamaalisuunnittelu sopiva, mutta jos sinulla ei ole kiire vaihtamaan pohjamaaleja, voit kokeilla ensin seuraavia menetelmiä (periaate on myös liitteenä):
·Nosta hehkutuslämpötilaa – yritä tehdä heikoista vetysidoksista kestämättömiä;
· Lyhennä hehkutus- ja venymisaikaa – vähennä heikkojen vetysidosten mahdollisuutta;
·Vähennä alukepitoisuutta – vähennä redundanttien alukkeiden ja ei-kohdealueiden sitoutumisen mahdollisuutta;
Alhainen vahvistusteho
Epäspesifiselle vahvistukselle päinvastainen tilanne – alhainen vahvistustehokkuus ja toimenpiteet alhaisen vahvistustehokkuuden hoitamiseksi ovat juuri päinvastaisia:
· Pidentää hehkutus- ja venymisaikaa;
·Vaihda kolmivaiheiseen PCR:ään ja alenna lämpökäsittelylämpötilaa;
·Lisää alukkeen pitoisuutta;
Ps: Monet 90-luvulla syntyneet jatko-opiskelijat eivät halua opiskella kokeiden virheenkorjausta ja toivovat, että sarja ratkaisee ongelman kokonaan (jos haluat mennä reagenssiyritykseen tutkimaan ja kehittämään valmistumisen jälkeen), itse asiassa reagenssien valmistajat ajattelevat myös näin, toivon, että se on hölmö. Sitä voidaan käyttää, kun saat sen, joten heikon valmistajien ponnistelujen ratkaiseminen, mm. -sidoksen absorptiotekijät.Ongelman helpottamiseksi tyhmien on silti luettava reagenssiyhtiön esittely nähdäkseen, onko olemassa tekijä, joka imee heikkoja vetysidoksia.
Vaikea alukepitoisuuden valinta ja ongelmia primer-dimeerien kanssa
Menetelmä 1: Yleisesti ottaen qPCR-sarjan ohjeissa on suositellut järjestelmät ja suositellut alukepitoisuudet.
Menetelmä 2: Virheenkorjaus asettamalla alukkeen pitoisuusgradientti.Alla oleva kuva on varastettu yritykseltä havainnollistamaan.Alla oleva kuva esittää fluoresenssin kvantitatiiviset tulokset, jotka on tehty kolmella alukkeen pitoisuusgradientilla (100 nM, 250 nM, 500 nM) ja neljällä templaattikonsentraatiogradientilla (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Koetulosten Ct-arvo piirretään seuraavasti:

Alukkeen pitoisuuden valinta Liitä jokainen alukekonsentraatio riviksi seuraavasti:

Alukepitoisuuden valinta on ilmeinen, 100 nM:n ja 250 nM:n alukepitoisuuden lineaarinen suhde on parempi ja 500 nM:n alukepitoisuuden lineaarinen suhde on suhteellisen huono.100 nM ja 250 nM Ct-arvo 250 nM on suhteellisen pieni, joten optimaalinen alukepitoisuus on 250 nM.Sulamiskäyrässä voidaan nähdä yleensä vakavia aluke-dimeerejä.Entä jos suunnitellut alukkeet eivät voi välttää aluke-dimeerejä?
Menetelmä 3: Vähennä alukkeiden määrää ja nosta hehkutuslämpötilaa (ei tarvitse selittää).
Hehkutuslämpötilan empiirinen arvo on 60°C.Jos et ole varma, kuinka valita sopivampi hehkutuslämpötila?Vastaus on sama kuin alukkeen pitoisuuden valinta -gradienttitesti.Ota kuva Bio-rad-yritykseltä havainnollistamaan ongelmaa.Tietyn kohdefragmentin monistamiseksi aseta kahdeksan lämpötilagradienttia, joista jokaisessa on kolme toistoa, ja saatu monistuskäyrä on seuraava:

hehkutuslämpötilan valinta:
·70°C, 69°C – Pohjimmiltaan alukkeita ei voi yhdistää, joten vahvistusta ei tapahdu.
·67,3°C – Alussa on vähän vahvistusta ja Ct-arvo on suhteellisen suuri.
·64,5°C——Ct-arvo pienenee.
· 60,7 °C:ssa, 58,0 °C:ssa, 56,2 °C:ssa ja 55,0 °C:ssa Ct-arvot olivat periaatteessa stabiileja, mutta lopulliset fluoresenssiarvot olivat erilaisia.
Kuinka valita?Periaate: Ensimmäinen periaate on suurempi Ct-arvo.Valitse samalle Ct-arvolle korkeampi hehkutuslämpötila dimerisoitumisen ja epäspesifisen vahvistumisen välttämiseksi.Vaikka fluoresenssiarvo on korkeampi 55 °C:ssa, siinä voi olla dimeerejä tai epäspesifistä vahvistusta.
Mutta jos olet yhtä älykäs kuin sinä, ajattelet varmasti: Loogisesti sanottuna, jos PCR-reaktio on hyvin spesifinen, niin kauan kuin alukkeen pitoisuus ylittää vähimmäisvaatimuksen, korkeilla ja alimmilla pisteillä ei pitäisi olla vaikutusta, kuten fluoresoivilla väriaineilla ja dNTP:illä.Todellakin, niin kauan kuin hehkutuslämpötila on optimoitu oikein, alukepitoisuuden vaikutus Ct-arvoon luonnollisesti minimoituu.

Hehkutuslämpötila on optimoitu oikein, ja alukepitoisuuden vaikutus CT:hen minimoituu
Toissijainen rakenne vaikuttaa vahvistuksen tehokkuuteen
Otetaan kuva Bio-radista ongelman havainnollistamiseksi.Se suunnittelee myös lämpötilagradientin sekundäärisen rakenteen omaavan geenin monistamiseksi.

Toissijainen rakenne syntyy
Voidaan nähdä, että lämpötilagradientin pienentyessä tuotteita alkaa ilmestyä ja Ct-arvo liikkuu eteenpäin saavuttaen minimiarvon 60,7 °C:ssa, ja sitten lämpötilagradientin pienentyessä Ct-arvo kasvaa.Sitä vastoin lämpötilan noustessa toisiorakenne avautuu ja vahvistusteho kasvaa.Tietyn lämpötilan saavuttamisen jälkeen lämpötilan nostaminen ei voi parantaa vahvistustehoa.Koska alukkeita ei voida yhdistää vakaasti tällä hetkellä.Siksi,etsi lämpötila, jolla on pienin Ct-arvo, joka on paras lämpötila toissijaisen rakennemallin vahvistamiseen!Tietysti fiksujen tyhmien on tiedettävä, että jos se ei ole välttämätöntä, on parasta vaihtaa alukkeet ja välttää toissijaista rakennealuetta.
5. Sovellustaso
MIQE – Data-analyysi

Tietojen analyysi saadaan pääasiassa fluoresoivalla kvantitatiivisella PCR-laitteella.Edellisessä artikkelissa on tehty paljon data-analyysityötä, kuten nollakontrolli, joka on selitetty kokeen suunnittelussa.Sisäiset vertailugeenit, toistonumerot jne. on selvitetty., tässä selitämme pääasiassa qPCR:n soveltamisen.
qPCR on laajalti käytetty, ja kokeellinen verifiointi ja nukleiinihappodiagnoosi ovat yleisimmin käytettyjä skenaarioita.
absoluuttinen kvantifiointi
Log (alkupitoisuudella) on lineaarinen suhde syklien lukumäärään.Standardista voidaan vetää standardikäyrä, jonka alkuperäinen kopioluku on tunnettu, eli voidaan saada monistusreaktion lineaarinen suhde.Näytteen Ct-arvon mukaan voidaan laskea näytteen pitoisuus.Mukana olevien mallien määrä.

Absoluuttinen kvantitatiivinen laskentamenetelmä
Absoluuttisen kvantifioinnin on perustuttava standardikäyrään.Standardikäyrän tekemiseksi tarvitaan standardi.Tavallisesti standardi on plasmidi, joka saadaan kloonaamalla kohdegeeni.Miksi se on plasmidi?Koska pyöreä plasmidi-DNA on stabiilin.Laimenna standardituote 5-6 gradientissa kaksinkertaistussuhteen mukaan (10-kertainen laimennus) ja kiinnitä huomiota tasaisuuteen laimentaessasi.Anna Ct-arvon olla välillä 15-30.

Normaali valmistelu
Samalla testattava näyte tulee myös laimentaa vastaavasti (muista laimennuskerroin), ja myös Ct-arvon tulee olla välillä 15-30.Vakiotuote + testattava näyte asetetaan koneelle yhdessä.Ajon jälkeen standardiaineella tehtiin standardikäyrä ja testattavat näytteet tuotiin standardikäyrään pitoisuuden laskemiseksi.
Hepatiitti B -viruksen HBV:n kvantifiointi on tyypillinen absoluuttinen kvantifiointi, jolla voidaan laskea viruksen kopiomäärä 1 ml:ssa verta.
Kopion numeron laskeminen
Testattavan näytteen pitoisuus (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × laimennuskerroin
Näytteen molekyylipaino = emästen lukumäärä × 324
Testattavan näytteen kopionumero (kopioita/ul) = testattavan näytteen pitoisuus / näytteen molekyylipaino × 6 × 1014

Kopion numeron laskentatapa

Yllä oleva on laskentamenetelmä määrän määrittämiseksi.Tämä on matemaattinen ongelma, joka voidaan ratkaista lukion jälkeen, ja matemaattiset ongelmat ratkaistaan ​​yleensä tietokoneilla.Jos et ymmärrä, voit tulla kommunikoimaan.
suhteellinen kvantifiointi
Suhteellista kvantifiointia käytetään pääasiassa tieteellisessä tutkimuksessa.Kuinka monta virusta on 1 ml:ssa verta, ja se on DNA-virus, tämä on suhteellisen deterministinen tapahtuma: veren määrä voidaan määrittää ja DNA-virus on suhteellisen vakaa.Meidän on kuitenkin vaikea verrata tietyn geenin transkriptiokopioiden määrää lehdellä, koska lehden koon, painon ja arkuuden määrittäminen on vaikeaa, uutetun RNA:n määrää on vaikea määrittää ja myös käänteistranskription tehokkuutta on vaikea määrittää, eli mikä tahansa vaihe voi saada kokeelliseen dataan virheitä, eikä niitä voida käyttää.
Siksi suhteellisen kvantifioinnin on sisällytettävä elementti:sisäinen vertailugeeni.
Toisin sanoen suhteellinen kvantifiointi on itse asiassa vertailu kohdegeenin ja sisäisen vertailugeenin välillä.Verrattuna samaan kudokseen ja samaan soluun näytekoon, RNA-uuttomäärän, käänteistranskription tehokkuuden ja PCR-tehokkuuden vaikutus on suhteellisen pieni.Pienen näytekoon vuoksi sekä sisäiset vertailugeenit että kohdegeenit olivat suhteellisen vähentyneet.Tästä syystä olemme aiemminkin korostaneet yhtenäisyyttä ja vakautta.
Sisäiset referenssigeenit ovat yleensäkodinhoitogeenit(house-keeping genes), jotka viittaavat geeniluokkaan, joka ilmentyy stabiilisti kaikissa soluissa, ja niiden tuotteet ovat välttämättömiä solujen peruselämän toimintojen ylläpitämiseksi.
Älä sekoita tätä käsitettä.Kotitalousgeenit ovat biologisen toiminnan termejä, kun taas sisäiset vertailugeenit ovat kokeellisia teknisiä termejä.Kotitalousgeenien on läpäistävä validointi ennen kuin ne voidaan valita sisäisiksi vertailugeeneiksi.
Esimerkiksi, valitsimme alla olevasta kuvasta useita taloudenhoitogeenejä testataksemme niiden ilmentymistasoja eri kudossoluissa ja havaitsimme, että β-2-mikroglobuliinin ilmentymistasot olivat melko erilaisia ​​kuin kolmen muun geenin, joten niitä ei voitu käyttää sisäisinä vertailugeeneina.

Sisäisen vertailugeenin korjausfunktion ymmärtämisen jälkeen johdetaan kaksi algoritmia sisäisen vertailugeenin lisäämisen vuoksi.
·kaksoisstandardikäyrämenetelmä
·2 – △△Ct-menetelmä (CT-arvojen vertailumenetelmä)
Jos olet kiinnostunut lajien ja geenien toimintojen tutkimisesta, luovu algoritmien tutkimuksesta ja käytä kaavoja suoraan tai käytä koneita suoraan;Jos olet suora mies matematiikassa ja tekniikassa, ole hyvä ja ota rohkeasti yhteyttä.
kaksoisstandardikäyrämenetelmä
Kvantifioi kontrollinäytteen ja testattavan näytteen kohdegeeni ja siivousgeeni standardikäyrän kautta ja laske sitten suhteellinen arvo laskentakaavan mukaan, joka on suhteellinen ilmentymistaso.
Edut: yksinkertainen analyysi, suhteellisen yksinkertainen kokeellinen optimointi
Haitta: Jokaiselle geenille jokaisen koekierroksen on tehtävä vakiokäyrä
Sovellus: Yksi kahdesta yleisimmin käytetystä ja tunnustetusta suhteellisesta kvantitatiivisesta menetelmästä geeniekspression säätelyn tutkimuksessa
Kaava on seuraava:

Esimerkkejä ovat seuraavat:

Laske suhteellinen määrä kvantitatiivisen tuloksen perusteella
2 – △△Ct-menetelmä (CT-arvojen vertailumenetelmä)

Edut: Ei tarvitse tehdä vakiokäyrää
Haitat: Oletetaan, että vahvistusteho on lähellä 100 %;standardipoikkeama on < 5 % ja standardikäyrän ja tehokkuuden kunkin vahvistuksen välillä oletetaan olevan johdonmukaisia;koeolosuhteiden optimointi on monimutkaisempaa.
Sovellus: Yksi kahdesta yleisimmin käytetystä ja tunnustetusta suhteellisesta kvantitatiivisesta menetelmästä geeniekspression säätelyn tutkimuksessa

Tietenkin monistustehokkuus on yleensä mahdotonta olla täydellinen 1. Korjausmenetelmä: Jos tiedämme, että kohdegeenillä ja vertailugeenillä on sama amplifikaatiotehokkuus, mutta amplifikaatiotehokkuus ei ole yhtä suuri kuin 1, niin 2－△△Ct voidaan korjata seuraavasti: (1+E )－△△, jos tehokkuus voi olla oikea amplifikaatioon esimerkiksi 0.9. 1,95 －△△Ct
Toistaiseksi fluoresoivaa kvantitatiivista PCR:ää koskeva sisältö on päättynyt.