Molekyylibiologian perustermien selitykset
1. cDNA ja cccDNA: cDNA on kaksijuosteinen DNA, joka on syntetisoitu käänteiskopioijalla mRNA:sta;cccDNA on plasmidin kaksijuosteinen suljettu pyöreä DNA, joka on vapaa kromosomista.
2. Normaali taittoyksikkö: proteiinin sekundaarirakenneyksikkö α-heliksi ja β-levy voivat muodostaa rakenteellisia lohkoja erityisillä geometrisilla järjestelyillä erilaisten yhdistävien polypeptidien kautta.Tämän tyyppistä määrättyä taittoa kutsutaan yleensä supersekundaarirakenteeksi.Lähes kaikki tertiääriset rakenteet voidaan kuvata näillä taittotyypeillä ja jopa niiden yhdistetyillä tyypeillä, joten niitä kutsutaan myös standarditaittoyksiköiksi.
3. CAP: syklinen adenosiinimonofosfaatti (cAMP) -reseptoriproteiini CRP (cAMP-reseptoriproteiini), cAMP:n ja CRP:n yhdistelmän jälkeen muodostunutta kompleksia kutsutaan aktivoivaksi proteiiniksi CAP (cAMP-aktivoitu proteiini)
4. Palindromisekvenssi: DNA-fragmentin segmentin käänteinen komplementaarinen sekvenssi, usein restriktioentsyymikohta.
5. micRNA: Komplementaarinen häiritsevä RNA tai antisense-RNA, joka on komplementaarinen mRNA-sekvenssille ja voi estää mRNA:n translaation.
6. Ribotsyymi: RNA, jolla on katalyyttinen aktiivisuus ja jolla on autokatalyyttinen rooli RNA:n silmukointiprosessissa.
7. Motiivi: Proteiinimolekyylien tilarakenteessa on joitain paikallisia alueita, joilla on samanlainen kolmiulotteinen muoto ja topologia
8. Signaalipeptidi: peptidi, jonka N-päässä on proteiinisynteesin aikana 15-36 aminohappotähdettä ja joka ohjaa proteiinin transmembraania.
9. Vaimentaja: Nukleotidisekvenssi operaattorialueen ja rakennegeenin välillä, joka lopettaa transkription.
10. Magic Spot: Kun bakteerit kasvavat ja kohtaavat täydellisen aminohappojen puutteen, bakteerit tuottavat hätäreaktion pysäyttääkseen kaikkien geenien ilmentymisen.Tämän hätäreaktion synnyttävät signaalit ovat guanosiinitetrafosfaatti (ppGpp) ja guanosiinipentafosfaatti (pppGpp).PpGpp:n ja pppGpp:n rooli ei ole vain yksi tai muutama operoni, vaan vaikuttaa suureen määrään niistä, joten niitä kutsutaan supersäätelijöiksi tai taikapisteiksi.
11. Ylävirran promoottorielementti: viittaa DNA-sekvenssiin, jolla on säätelevä rooli promoottorin aktiivisuudessa, kuten TATA alueella -10, TGACA alueella -35, tehostajat ja vaimentajat.
12. DNA-koetin: leimattu DNA-segmentti, jolla on tunnettu sekvenssi ja jota käytetään laajalti tuntemattomien sekvenssien havaitsemiseen ja kohdegeenien seulomiseen.
13. SD-sekvenssi: Se on ribosomin ja mRNA:n sitoutumissekvenssi, joka säätelee translaatiota.
14. Monoklonaalinen vasta-aine: vasta-aine, joka toimii vain yhtä antigeenideterminanttia vastaan.
15. Kosmidi: Se on keinotekoisesti rakennettu eksogeeninen DNA-vektori, joka säilyttää COS-alueet faagin molemmissa päissä ja on kytketty plasmidiin.
16. Sinivalkopilkkuseulonta: LacZ-geeni (koodaa β-galaktosidaasia), entsyymi voi hajottaa kromogeenisen substraatin X-gal (5-bromi-4-kloori-3-indoli-β-D-galaktosidi) tuottaen sinistä, jolloin kanta tulee siniseksi.Kun eksogeeninen DNA insertoidaan, LacZ-geeniä ei voida ilmentää, ja kanta on valkoinen rekombinanttibakteerien seulomiseksi.Tätä kutsutaan sinivalkoiseksi seuloksi.
17. Cis-toiminen elementti: DNA:n spesifinen emässekvenssi, joka säätelee geenin ilmentymistä.
18. Klenow-entsyymi: DNA-polymeraasi I:n suuri fragmentti, paitsi että 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuus poistetaan DNA-polymeraasi I -holoentsyymistä
19. Ankkuroitu PCR: käytetään monistamaan kiinnostavaa DNA:ta tunnetulla sekvenssillä toisessa päässä.Poly-dG-häntä lisättiin tuntemattoman sekvenssin toiseen päähän, ja sitten poly-dC:tä ja tunnettua sekvenssiä käytettiin alukkeina PCR-monistukseen.
20. Fuusioproteiini: Eukaryoottisen proteiinin geeni on yhteydessä eksogeeniseen geeniin, ja alkuperäisen geeniproteiinin ja eksogeenisen proteiinin translaatiosta koostuva proteiini ilmentyy samanaikaisesti.
Muut molekyylibiologian termit
1. DNA:n fyysinen kartta on järjestys, johon DNA-molekyylin (restriktioendonukleaasipilkotetut) fragmentit on järjestetty.
2. RNaasin pilkkominen on jaettu kahteen tyyppiin (autokatalyysi) ja (heterokatalyysi).
3. Prokaryooteissa on kolme aloitustekijää: (IF-1), (IF-2) ja (IF-3).
4. Transmembraaniproteiinit vaativat ohjausta (signaalipeptidit), ja proteiinikaperonien rooli on (auttaa laskostamaan peptidiketjun proteiinin natiiviksi konformaatioksi).
5. Promoottorien elementit voidaan yleensä jakaa kahteen tyyppiin: (ydinpromoottorielementit) ja (ylävirran promoottorielementit).
6. Molekyylibiologian tutkimussisältö koostuu pääosin kolmesta osasta: (rakennemolekyylibiologia), (geeniekspressio ja -säätely) ja (DNA-rekombinaatioteknologia).
7. Kaksi keskeistä koetta, jotka osoittavat, että DNA on geneettinen materiaali, ovat (hiirten pneumokokki-infektio) ja (Escherichia colin T2-faagiinfektio).potentiaali).
8. hnRNA:n ja mRNA:n välillä on kaksi pääeroa: (hnRNA silmukoituu mRNA:ksi muuntumisprosessissa), (mRNA:n 5'-päähän lisätään m7pGppp-suojus, ja mRNA-hapon (polyA) hännän 3'-päässä on ylimääräistä polyadenylaatiota).
9. Proteiinin monialayksikkömuodon etuja ovat (alayksikkö on taloudellinen menetelmä DNA:n hyödyntämiseen), (voi vähentää proteiinisynteesin satunnaisten virheiden vaikutusta proteiinin aktiivisuuteen), (aktiivisuutta voidaan avata ja sulkea erittäin tehokkaasti ja nopeasti).
10. Proteiinin laskostumismekanismin ensimmäisen nukleaatioteorian pääsisältöön kuuluvat (nukleaatio), (rakenteellinen rikastuminen), (lopullinen uudelleenjärjestely).
11. Galaktoosilla on kaksinkertainen vaikutus bakteereihin;toisaalta (se voidaan käyttää hiilen lähteenä solujen kasvuun);toisaalta (se on myös osa soluseinää).Siksi tarvitaan cAMP-CRP-riippumaton promoottori S2 pysyvään synteesiin taustatasolla;samaan aikaan tarvitaan cAMP-CRP-riippuvaista promoottoria S1 säätelemään korkean tason synteesiä.Transkriptio alkaa (S2) G:llä ja (S1) ilman G:tä.
12. Yhdistelmä-DNA-tekniikka tunnetaan myös nimellä (geenikloonaus) tai (molekyylikloonaus).Lopullinen tavoite on (siirtää geneettisen informaation DNA yhdessä organismissa toiseen organismiin).Tyypillinen DNA-rekombinaatiokoe sisältää yleensä seuraavat vaiheet: (1) Pura luovuttajaorganismin kohdegeeni (tai eksogeeninen geeni) ja yhdistä se entsymaattisesti toiseen DNA-molekyyliin (kloonausvektoriin) uuden yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi.② Rekombinantti-DNA-molekyyli siirretään vastaanottajasoluun ja replikoituu vastaanottajasolussa.Tätä prosessia kutsutaan transformaatioksi.③ Seulo ja tunnista ne vastaanottajasolut, jotka ovat absorboineet yhdistelmä-DNA:ta.④ Viljele soluja, jotka sisältävät suuria määriä rekombinantti-DNA:ta, jotta voidaan havaita, ilmentyykö vieraan avun geeni.
13. Plasmidireplikaatiota on kahta tyyppiä: isäntäsolun proteiinisynteesin tiukasti kontrolloimia plasmideja kutsutaan (tiiviiksi plasmideiksi) ja niitä, joita isäntäsolun proteiinisynteesi ei kontrolloi tiukasti, kutsutaan (relaksoiduiksi plasmideiksi).
14. PCR-reaktiojärjestelmällä tulee olla seuraavat olosuhteet: a.DNA-alukkeet (noin 20 emästä), joissa on komplementaariset sekvenssit erotettavan kohdegeenin kahden juosteen kummassakin päässä.b.Entsyymit, joilla on lämpöstabiilisuus, kuten: TagDNA-polymeraasi.c, dNTPd, mielenkiinnon kohteena oleva DNA-sekvenssi templaattina
15. PCR:n perusreaktioprosessi sisältää kolme vaihetta: (denaturointi), (pariutuminen) ja (pidennys).
16. Siirtogeenisten eläinten perusprosessi sisältää yleensä: ①Kloonatun vieraan geenin viemisen hedelmöittyneen munan tai alkion kantasolun tumaan;②Inokuloidun hedelmöitetyn munasolun tai alkion kantasolun siirto naisen kohtuun;③ Täydellinen alkion kehitys ja kasvu Vieraita geenejä omaaville jälkeläisille;④ Käytä näitä vieraita proteiineja tuottavia eläimiä jalostuskannaksi uusien homotsygoottisten linjojen kasvattamiseen.
17. Hybridoomasolulinjat tuotetaan hybridisoimalla (perna B) solut (myelooma) solujen kanssa, ja koska (pernasolut) voivat hyödyntää hypoksantiinia ja (luusolut) tarjota solunjakotoimintoja, niitä voidaan kasvattaa HAT-elatusaineessa.kasvaa.
18. Tutkimuksen syventyessä ensimmäinen vasta-ainesukupolvi on nimeltään (polyklonaaliset vasta-aineet), toinen sukupolvi (monoklonaaliset vasta-aineet) ja kolmas sukupolvi (geenitekniikan vasta-aineet).
19. Tällä hetkellä hyönteisvirusten geenitekniikka keskittyy pääasiassa bakulovirukseen, joka ilmenee (eksogeenisen toksiinigeenin);(geenit, jotka häiritsevät hyönteisten normaalia elinkaarta);(virusgeenien muuntaminen).
20. Trans-vaikuttavat proteiinitekijät, jotka vastaavat nisäkkään RNA-polymeraasi II -promoottorin yhteisiä elementtejä TATA, GC ja CAAT, ovat (TFIID), (SP-1) ja (CTF/NF1), vastaavasti.
kaksikymmentäyksi.RNA-polymeraasin Ⅱ perustranskriptiotekijät ovat TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, ja niiden sitoutumissekvenssi on: (D, A, B, E).Jossa TFII-D:n toiminto on (sitoutuminen TATA-laatikkoon).
kaksikymmentäkaksi.Suurin osa DNA:han sitoutuvista transkriptiotekijöistä toimii dimeerien muodossa.DNA:han sitoutuvien transkriptiotekijöiden funktionaaliset domeenit ovat yleensä seuraavat (helix-turn-helix), (sinkkisormi-aihe), (emäs-leusiini) vetoketjumotiivi).
kaksikymmentäkolme.On olemassa kolmenlaisia restriktioendonukleaasin katkaisutiloja: (leikataan symmetria-akselin 5'-puolelta 5'-tahmeiden päiden luomiseksi), (leikkaus symmetria-akselin 3'-puolelta 3'-tahmeiden päiden muodostamiseksi (leikkaus symmetria-akselilta tasaisten segmenttien muodostamiseksi) ).
kaksikymmentäneljä.Plasmidi-DNA:lla on kolme erilaista konfiguraatiota: (SC-konfiguraatio), (oc-konfiguraatio), (L-konfiguraatio).Ensimmäinen elektroforeesissa on (SC-konfiguraatio).
25. Eksogeeniset geeniekspressiojärjestelmät, pääasiassa (Escherichia coli), (hiiva), (hyönteiset) ja (nisäkässolutaulukko).
26. Siirtogeenisille eläimille yleisesti käytetyt menetelmät ovat: (retrovirusinfektiomenetelmä), (DNA-mikroinjektiomenetelmä), (alkion kantasolumenetelmä).
Sovellus Molekyylibiologia
1. Nimeä yli 5 RNA:n tehtävät?
Transfer RNA tRNA Transfer aminohappo Ribosomi RNA rRNA Ribosomi muodostaa lähetti-RNA:n mRNA Proteiinisynteesi templaatti Heterogeeninen ydin-RNA hnRNA Kypsän mRNA:n esiaste pieni tuma-RNA snRNA Osallistuu hnRNA:n silmukointiin Pienet sytoplasmiset RNA:n tunnistuskomponentit AntRNA:n synteettinen RNA:n proteiinisisoitunut RNA-scRNA/7SL-RNA-plasma-plasma-solut /micRNA Säätelee geenin ilmentymistä Ribotsyymi-RNA Entsymaattisesti aktiivinen RNA
2. Mikä on tärkein ero prokaryoottisten ja eukaryoottisten promoottorien välillä?
Prokaryoottinen TTGACA --- TATAAT------Initiation Site-35 -10 Eukaryotic Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Aloituspaikka-110 -70 -25
3. Mitkä ovat tärkeimmät näkökohdat luonnollisten plasmidien keinotekoisessa rakentamisessa?
Luonnollisissa plasmideissa on usein puutteita, joten ne eivät sovellu käytettäväksi geenitekniikan kantajina, ja niitä on muunnettava ja rakennettava: a.Lisää sopivia valintamerkkigeenejä, kuten kaksi tai useampia, joita on helppo käyttää valintaan, yleensä antibioottigeenit.b.Lisää tai vähennä sopivia entsyymileikkauskohtia rekombinaation helpottamiseksi.c.Lyhennä pituutta, leikkaa turhat palaset pois, paranna tuontitehokkuutta ja lisää lastauskapasiteettia.d.Muuta replikonia tiukasta löysäksi, harvemmasta kopiomäärästä enemmän kopioita.e.Lisää erityisiä geneettisiä elementtejä geenitekniikan erityisvaatimusten mukaisesti
4. Anna esimerkki menetelmästä kudosspesifisen cDNA:n differentiaaliseen seulomiseen?
Valmistetaan kaksi solupopulaatiota, kohdegeeni ekspressoituu tai ilmentyy voimakkaasti toisessa solussa ja kohdegeeni ei ilmenty tai ilmentyy vähän toisessa solussa, ja sitten kohdegeeni löydetään hybridisaatiolla ja vertailulla.Esimerkiksi kasvainten esiintymisen ja kehittymisen aikana kasvainsolut esittävät mRNA:ita, joilla on erilaiset ekspressiotasot kuin normaalit solut.Siksi kasvaimeen liittyvät geenit voidaan seuloa differentiaalisella hybridisaatiolla.Induktiomenetelmällä voidaan myös seuloa geenit, joiden ilmentyminen indusoituu.
5. Hybridoomasolulinjojen generointi ja seulonta?
Pernan B-solut + myeloomasolut, lisää polyetyleeniglykolia (PEG) edistääksesi solufuusiota, ja pernan B-myelooma-fuusiosolut, jotka on kasvatettu HAT-elatusaineessa (sisältää hypoksantiinia, aminopteriinia, T) jatkavat ravinnon laajentamista.Solufuusio sisältää: perna-perna -fuusiosolut: eivät kykene kasvamaan, pernasoluja ei voida viljellä in vitro.Luu-luu-fuusiosolut: eivät pysty hyödyntämään hypoksantiinia, mutta voivat syntetisoida puriinia toisen reitin kautta käyttämällä folaattireduktaasia.Aminopteriini estää folaattireduktaasia, joten se ei voi kasvaa.Luun ja pernan fuusiosolut: voivat kasvaa HAT:ssa, pernasolut voivat hyödyntää hypoksantiinia ja luusolut tarjoavat solunjakotoimintoa.
6. Millä periaatteella ja menetelmällä DNA:n primäärirakenne määritetään dideoksipäätteisellä terminaatiomenetelmällä (Sangerin menetelmä)?
Periaatteena on käyttää nukleotidiketjun terminaattoria – 2,,3,-dideoksinukleotidia DNA:n pidentämisen lopettamiseksi.Koska siitä puuttuu 3/5/fosfodiesterisidosten muodostamiseen tarvittava 3-OH, kun se on liitetty DNA-ketjuun, DNA-ketjua ei voida jatkaa.Emäspariutumisen periaatteen mukaan aina kun DNA-polymeraasi tarvitsee dNMP:tä osallistuakseen normaalisti pidentyneeseen DNA-ketjuun, on kaksi mahdollisuutta, yksi on osallistua ddNTP:hen, mikä johtaa deoksinukleotidiketjun pidentämisen lopettamiseen;toinen on osallistua dNTP:hen, jotta DNA-ketju voi silti jatkaa pidentymistä, kunnes seuraava ddNTP on sisällytetty.Tämän menetelmän mukaisesti voidaan saada ryhmä eripituisia DNA-fragmentteja, jotka päättyvät ddNTP:hen.Menetelmä on jakaa neljään ryhmään, vastaavasti ddAMP, ddGMP, ddCMP ja ddTMP.Reaktion jälkeen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla voidaan lukea DNA-sekvenssi uimavyöhykkeiden mukaisesti.
7. Mikä on aktivaattoriproteiinin (CAP) positiivinen säätelyvaikutus transkriptioon?
Syklinen adenylaatti (cAMP) -reseptoriproteiini CRP (cAMP-reseptoriproteiini), cAMP:n ja CRP:n yhdistelmästä muodostuvaa kompleksia kutsutaan CAP:ksi (cAMP-aktivoitu proteiini).Kun E. colia kasvatetaan alustassa, josta puuttuu glukoosi, CAP:n synteesi lisääntyy ja CAP:n tehtävänä on aktivoida promoottoreita, kuten laktoosia (Lac).Joistakin CRP-riippuvaisista promoottoreista puuttuu tyypillinen -35-alueen sekvenssiominaisuus (TTGACA), joka yleisillä promoottoreilla on.Siksi RNA-polymeraasin on vaikea sitoutua siihen.CAP:n läsnäolo (toiminto): voi merkittävästi parantaa entsyymin ja promoottorin sitoutumisvakiota.Se osoittaa pääasiassa seuraavat kaksi näkökohtaa: ① CAP auttaa entsyymimolekyyliä orientoitumaan oikein muuttamalla promoottorin konformaatiota ja vuorovaikutusta entsyymin kanssa siten, että se yhdistyy -10-alueen kanssa ja korvaa -35-alueen toiminnan.②CAP voi myös estää RNA-polymeraasin sitoutumisen DNA:n muihin kohtiin, mikä lisää todennäköisyyttä sitoutua spesifiseen promoottoriinsa.
8. Mitä vaiheita yleensä sisältyy tyypilliseen DNA-rekombinaatiokokeeseen?
a.Pura luovuttajaorganismin kohdegeeni (tai eksogeeninen geeni) ja yhdistä se entsymaattisesti toiseen DNA-molekyyliin (kloonausvektoriin) uuden rekombinantti-DNA-molekyylin muodostamiseksi.b.Siirrä rekombinantti-DNA-molekyyli vastaanottajasoluun ja replikoi ja säilytä se vastaanottajasolussa.Tätä prosessia kutsutaan transformaatioksi.c.Seulo ja tunnista ne vastaanottajasolut, jotka ovat absorboineet yhdistelmä-DNA:ta.d.Rekombinantti-DNA:n sisältäviä soluja massaviljelyllä sen havaitsemiseksi, ekspressoituuko vieras apugeeni.
9. Geenikirjaston rakentaminen Esitetään kolme menetelmää rekombinanttien seulomiseksi ja prosessi kuvataan lyhyesti.
Antibioottiresistenssiseulonta, resistenssin insertioinaktivointi, sinivalkopisteseulonta tai PCR-seulonta, differentiaaliseulonta, DNA-koetin Useimmat kloonausvektorit sisältävät antibioottiresistenssigeenejä (anti-ampisilliini, tetrasykliini).Kun plasmidi siirretään Escherichia coliin, bakteerit saavat resistenssin, ja niillä, joilla ei ole siirtoa, ei ole resistenssiä.Mutta se ei voi erottaa, onko se organisoitu uudelleen vai ei.Jos vektorissa, joka sisältää kaksi resistenssigeeniä, toiseen geeneihin liitetään vieras DNA-fragmentti ja se saa geenin inaktivoitumaan, voidaan käyttää kahta eri lääkettä sisältävää levykontrollia positiivisten rekombinanttien seulomiseen.Esimerkiksi pUC-plasmidi sisältää LacZ-geenin (koodaa β-galaktosidaasia), joka voi hajottaa kromogeenisen substraatin X-gal (5-bromi-4-kloori-3-indoli-β-D-galaktosidi) tuottaen sinistä, mikä muuttaa kannan siniseksi.Kun vieras DNA insertoidaan, LacZ-geeniä ei voida ekspressoida, ja kanta on valkoinen rekombinanttibakteerien seulomiseksi.
10. Selitä perusprosessi siirtogeenisten eläinten saamiseksi alkion kantasolujen kautta?
Alkion kantasolut (ES) ovat alkion kehitysvaiheessa olevia alkiosoluja, joita voidaan viljellä ja lisääntyä keinotekoisesti ja joiden tehtävänä on erilaistua muun tyyppisiksi soluiksi.ES-solujen viljely: Blastokystan sisäinen solumassa eristetään ja viljellään.Kun ES:tä viljellään syöttäjättömässä kerroksessa, se erilaistuu erilaisiksi toiminnallisiksi soluiksi, kuten lihassoluiksi ja N-soluiksi.Kun viljellään fibroblasteja sisältävässä alustassa, ES säilyttää erilaistumisfunktion.ES:tä voidaan manipuloida geneettisesti, ja sen erilaistumistoiminto voidaan integroida vaikuttamatta sen erilaistumistoimintoon, mikä ratkaisee satunnaisen integraation ongelman.Vie eksogeeniset geenit alkion kantasoluihin, istuta ne sitten raskaana olevien naarashiirten kohtuun, kehittyvät pentuiksi ja risteytetään homotsygoottisten hiirten saamiseksi.
