1. Havaitse RNA-liuoksen absorbanssi
Absorbanssi aallonpituudella 280, 320, 230 ja 260 nm edustaa vastaavasti nukleiinihapon, taustan (liuoksen sameus), suolapitoisuuden ja orgaanisen aineen, kuten proteiinin, arvoja.Yleensä katso vain OD260/OD280 (suhde, R).Kun 1,8-2,0, uskomme, että proteiinin tai muun orgaanisen aineen kontaminaatio RNA:ssa voidaan sietää, mutta on huomioitava, että kun Trisiä käytetään puskurina absorbanssin havaitsemiseen, R-arvo voi olla suurempi kuin 2 (yleensä sen tulisi olla <2,2).Kun R<1,8, proteiinin tai muun orgaanisen aineen saastuminen liuoksessa on selvempää ja RNA:n kohtalo voidaan määrittää tarpeiden mukaan.Kun R>2,2, se tarkoittaa, että RNA on hydrolysoitunut yhdeksi nukleiinihapoksi.
2. RNA:n elektroforeettinen kuvio
Yleensä denaturoivaa geeliä käytetään RNA-elektroforeesiin, mutta jos se on vain RNA:n laadun havaitsemiseen, denaturoivaa geeliä ei tarvita, vaan voidaan käyttää tavallista agaroosigeeliä.Elektroforeesin tarkoituksena on havaita 28S- ja 18S-vyöhykkeiden eheys ja niiden suhde tai mRNA-smearin eheys.Yleensä, jos 28S- ja 18S-nauhat ovat kirkkaita, selkeitä ja teräviä (viittaen vyöhykkeiden reunat ovat selkeitä) ja 28S:n kirkkaus on yli kaksi kertaa 18S-kaistan kirkkaus, pidämme RNA:n laatua hyvänä.
Yllä olevat ovat kaksi menetelmää, joita käytämme yleisesti, mutta kumpikaan näistä kahdesta menetelmästä ei voi selvästi kertoa meille, onko RNA-liuoksessa jäännös-RNaasi.Jos liuoksessa on hyvin pieni määrä RNaasia, meidän on vaikea havaita sitä yllä olevalla menetelmällä, mutta suurin osa myöhemmistä entsymaattisista reaktioista suoritetaan yli 37 asteen lämpötilassa ja pitkään.Tällä tavalla, jos RNA-liuoksessa on hyvin pieni määrä RNaasia, niin siellä on erittäin sopiva ympäristö ja aika suorittaa roolinsa seuraavissa kokeissa, ja tietysti koe on tällä hetkellä kylmä.Alla esittelemme menetelmän, joka voi varmistaa, onko RNA-liuoksessa jäljellä RNaasi.
3. Lämmön säilyvyystesti
Ota näytepitoisuuden mukaan kaksi 1000 ng RNA:ta RNA-liuoksesta ja lisää se 0,5 ml:n sentrifugiputkeen ja täydennä sitä pH 7,0 Tris-puskurilla 10 ul:n kokonaistilavuuteen ja sulje sitten putken korkki.Laita yksi niistä vakiolämpöiseen 70°C vesihauteeseen ja pidä lämpimänä 1 tunti.Toinen osa säilytettiin -20°C jääkaapissa 1 tunti.Kun aika on kulunut, poista kaksi näytettä elektroforeesia varten.Kun elektroforeesi on valmis, vertaa näiden kahden elektroforeettisia vyöhykkeitä.Jos näiden kahden vyöhykkeet ovat yhdenmukaisia tai niillä ei ole merkittävää eroa (tietysti myös niiden vyöhykkeet täyttävät menetelmän 2 ehdot), se tarkoittaa, että RNA-liuoksessa ei ole jäännös-RNaasikontaminaatiota ja RNA:n laatu on erittäin hyvä.Päinvastoin, jos 70 °C:ssa inkuboitu näyte osoittaa ilmeistä hajoamista, se osoittaa, että RNA-liuoksessa on RNaasi-kontaminaatiota.
2 Kokeelliset menetelmät ja tekniikat RNA:n uuttamiseen
Ongelmat, joita kohtaamme usein RNA:ta uuttaessaan, ovat: (1) RNA:n saanto on alhainen;(2) RNA:lla on vakava suolasaaste;(3) RNA:ssa on vakava orgaanisten liuottimien saastuminen;(4) näytteen hajoaminen ja muut ongelmat
1. Yleisesti käytetyt kokonais-RNA:n uuttoreagenssit
Guanidiini-isotiosyanaattimenetelmä ja Trizol-menetelmä ovat yleisimmin käytetyt menetelmät kokonais-RNA:n uuttamiseen eläinkudoksista ja eläinsoluista.Se sopii erityisen hyvin pienille näytteille ja kudoksille, joita on erityisen vaikea uuttaa, kuten kokonais-RNA:n uuttamiseen kanin ihosta ja eläinten sidekudoksesta;lisäksi Trizolia voidaan yleiskäyttöisenä lyysireagenssina käyttää myös kasvikudosten, bakteerien, sienten ja muiden kudosten uuttamiseen.Polysakkarideja ja polyfenoleja sisältäville kasvikudoksille, kuten Camellia oleiferalle, teelehdille, rapsille jne., CTAB-menetelmää voidaan käyttää myös kokonais-RNA:n erottamiseen.
Perinteisenä menetelmänä kaksoispylväsmenetelmä on myös erittäin suosittu, koska se toimii normaalissa lämpötilassa, ei tarvitse lisätä RNaasia ja turvallisuus – ei kloroformia, fenoleja ja muita orgaanisia reagensseja uuttamiseen.(suositellut tuotteet )
2. Kokonais-RNA:n uuttaminen eläinkudoksista
(1) Yritä valita tuoretta pehmopaperia, jos se ei ole tuoretta (mieluiten kolmen kuukauden sisällä - 80 ℃ jääkaapissa tai nestetypessä pakastettuna. Kun leikkaat pehmopaperia, älä leikkaa suoraan huoneenlämmössä, muista Laita se jäälaatikon päälle, yritä välttää toistuvaa jäätymistä ja sulattamista.
(2) Leikkaa pieni kudospala puhtailla saksilla ja pinseteillä, yritä leikata kudoksen keskiosa näytettä leikkaaessasi tai leikkaa ensin suuri kudospala keskeltä ja leikkaa näyte sitten tuoreesta viillosta.Poistettu kudos tulee silputa kokonaan, laittaa silputtu kudos EP-putkeen ilman RNaasia, lisätä lysaatti, silputtu kudos tulee altistaa kokonaan lysaatille ja valmistautua homogenisointiin.
(3) Valitse normaaleille kudoksille mungpavun kokoisia kudoksia (30–60 mg) homogenisointia varten.Jos kudokset sisältävät suuren määrän proteiinia, rasvaa tai tiheitä kuitukudoksia, kuten maksa, lisää tai vähennä leikattujen kudosten määrää (valinnainen) Valitse 10–20 mg).
(4) Jos kalalihasta, katkarapujen lihaa, meduusoja ja muita runsaasti vettä sisältäviä kudoksia uutetaan, näytetilavuutta on lisättävä asianmukaisesti (suositus 100-200 mg).
(5) Jos olosuhteet sen sallivat, eläinkudos voidaan uuttaa suoraan sen jälkeen, kun se on homogenisoitu korkean päästön kudoshomogenisaattorilla, jos tällaista laitteistoa ei ole.
(6) Lopullisen uuton jälkeen saatu RNA on asetettava välittömästi jääkaappiin RNA:n hajoamisen vähentämiseksi.
3. Eläinsolujen RNA:n uuttaminen
(1) Suspensiosolut: sentrifugoi suoraan ja hävitä väliaine, pese steriilillä PBS:llä 1-2 kertaa, suspendoi sitten sopivalla määrällä PBS:ää ja lisää sitten lysaattia lyysiä varten.Älä lisää lysaattia suoraan saostuneisiin soluihin nesteen täydellisen hävittämisen jälkeen.Tämä saa histonipakkauksen, joka vapautuu ulomman kerroksen hajottujen solujen jälkeen, kiinnittymään saostettujen solujen ulkopuolelle, mikä rajoittaa pelletin sisällä olevien solujen kosketusta lysaatin kanssa., mikä johtaa epätäydelliseen solulyysiin ja vähentyneeseen RNA:n saantoon.
(2) Solut, jotka ovat puolikiinnittyneitä tai eivät tiukasti kiinnittyneet: Kun elatusaine on poistettu, pese PBS:llä 1-2 kertaa, ime sitten suoraan sopiva määrä PBS:ää ja puhalla viljelymalja pipetillä tai pistoolilla solujen puhaltamiseksi pois ja siirrä ne RNA-vapaisiin soluihin.Lisää lysaatti entsyymin EP-putkeen uuttamista varten.
(3) Kiinnittyneet solut: ne on pilkottava ensin trypsiinillä, kerättävä sitten RNaasivapaisiin EP-putkiin, sentrifugoitava supernatantin poistamiseksi, pestävä 1-2 kertaa PBS:llä ylimääräisen trypsiinin poistamiseksi ja suspendoitava uudelleen sopivaan määrään PBS:ää. Siirry sitten uuttovaiheeseen.
4. Kasvien RNA:n uuttaminen
Kasvikudokset ovat runsaasti fenoliyhdisteitä tai runsaasti polysakkarideja tai sisältävät joitain tunnistamattomia sekundaarisia metaboliitteja tai niillä on korkea RNaasi-aktiivisuus.Nämä aineet yhdistyvät tiiviisti RNA:n kanssa solujen hajoamisen jälkeen muodostaen liukenemattomia komplekseja tai kolloidisia saostumia, joita on vaikea poistaa.Siksi, kun poimimme kasvikudosta, meidän on valittava kasveille tarkoitettu sarja.Sarjan lysaatti voi ratkaista tehokkaasti polyfenolien helpon hapettumisen sekä polysakkaridiyhdisteiden ja nukleiinihappojen erottamisen ongelmat.
(Polysakkaridipolyfenolikasvien RNA-uuttoon suositellut tuotteet:
(1) Kasvin kuori, hedelmäliha, siemenet, lehdet jne. on jauhettava kokonaan huhmareessa.Jauhatusprosessin aikana nestemäistä typpeä tulee lisätä ajoissa näytteen sulamisen välttämiseksi.Jauhettu näyte tulee lisätä nopeasti lysaattiin ja ravistaa RNA:n hajoamisen välttämiseksi.
(2) Kuitupitoisten näytteiden, kuten riisin ja vehnän lehtien, uuttamisen määrää tulee vähentää asianmukaisesti, muuten kudosten jauhaminen ja lyysi eivät ole täydellisiä, mikä johtaa uutetun RNA:n alhaiseen saantoon.
(3) Kasvikudoksissa, joissa on korkea vesipitoisuus, kuten granaattiomenan hedelmät, vesimelonin hedelmät, persikkahedelmät jne., näytekokoa olisi suurennettava asianmukaisesti (100–200 mg on valinnainen).
(4) Kasvikudoksissa, kuten kasvien lehdet, juurakot, kovat hedelmät ja muut materiaalit, suositellaan yleensä käyttämään nestemäistä typpeä ainesosien perusteelliseen laastimiseen huhmareessa ja siirtymään sitten uuttovaiheeseen.Perinteiset kudoshomogenisaattorit eivät ehkä ole tehokkaita kasvien kudosten homogenoinnissa, eikä niitä yleensä suositella.
5. Varotoimet RNA:n uuttamiseksi
(1) Kudosnäytteiden tulee olla mahdollisimman tuoreita toistuvan jäätymisen ja sulamisen välttämiseksi.
(2) Kudosten tulee olla täysin jauhettua uuttamisen aikana, eikä kudoksen määrä saa olla liian vähän, saati liian paljon.
(3) Lysaatin lisäämisen jälkeen on annettava riittävästi inkubointiaikaa, jotta näyte hajoaa kokonaan.
(4) Käytettäessä Trizol-menetelmää uuttamiseen supernatantin imeytymisen periaatteena kerrostumisen jälkeen on "mieluummin hengittää vähemmän kuin hengittää enemmän", eikä se saa uuttaa keskikerrokseen, muuten se aiheuttaa vakavan genomisen DNA-kontaminaation.
(5) Pesun aikana pesunesteen tulee imeytyä kokonaan putken seinämän ympärille perusteellisen pesun varmistamiseksi.
(6) Kolonniuuttomenetelmässä sen lisäksi, että pylväs irrotetaan pesun jälkeen, adsorptiokolonni olisi myös asetettava erittäin puhtaaseen penkkiin ja puhallettava 5–10 minuuttia, jotta orgaaninen liuotin haihtuu kokonaan kuiviin.
(7) Pylväsmenetelmän viimeisessä eluoinnissa DEPC-veden lisäämisen jälkeen sitä tulisi inkuboida 3-5 minuuttia tai DEPC-vesi tulee kuumentaa etukäteen 60 °C:seen eluointisaannon lisäämiseksi.Perinteisessä Trizol-pilkkomis- ja isopropanolisaostusmenetelmässä lopullinen RNA liuotetaan DEPC-veteen, joten liukenemiselle tulee antaa sopiva aika ja sentrifugiputken pohjaa tulee jatkuvasti puhaltaa pipetin kärjellä.
3 T3 Syitä ja ratkaisuja alhaiseen RNA-pitoisuuteen/huonoon laatuun
1. Sato on liian alhainen
Uutettu näyte on liian pieni, kokonaismäärä on riittämätön tai uutettua näytettä on liikaa ja hajoaminen ei ole täydellistä;uuttamiseen tulee käyttää laadukasta kudosta tai soluja, näytteen esikäsittely on suoritettava hyvin ja lyysin tulee olla riittävä.
2. Genomijäämät
Kun uuttamalla Trizol-menetelmällä supernatantti imetään keskikerrokseen kerrostamisen jälkeen, seurauksena on vakava genomikontaminaatio;Kerrostuksessa tulee olla erityisen varovainen, jotta vältetään imeytymistä keskikerrokseen.Jos uuttamiseen käytetään pylväsmenetelmää, uuttamiseen voidaan valita DNaasi I:tä sisältävä pakkaus.Kalvolle adsorboitu nukleiinihappo pilkotaan suoraan DNaasi I:llä, mikä voi vähentää suuresti DNA-tähteitä.
3. RNA:n hajoaminen
Se voi olla itse uutetun näytteen hajoamista tai uuttoprosessin aikana aiheutunutta hajoamista;RNA-uuttoon tulee mahdollisuuksien mukaan käyttää tuoreita näytteitä ja kerätyt näytteet tulee säilyttää ajoissa nestetypessä tai -80°C jääkaapissa ja toistuvaa pakastusta ja sulattamista tulee välttää.RNAasi/DNaasivapaita kärkiä, sentrifugiputkia ja muita materiaaleja tulee käyttää RNA:n uuttoprosessissa.Poistoprosessin tulee olla mahdollisimman nopea.Uutettu RNA tulee sijoittaa jäälaatikkoon ja säilyttää -80 °C:ssa ajoissa.Jos uutettu RNA on tunnistettava geelielektroforeesilla, elektroforeesi on suoritettava välittömästi uuttamisen jälkeen ja elektroforeesipuskuri tulee korvata uudella valmistetulla puskurilla.
4. Suola ja orgaaniset liuotinjäämät
Uuttoreagenssit sisältävät fenoli- ja guanidiinisuoloja ja pesuliuos etanolia.Uuttoprosessin aikana lysaatti ei täysin imeytynyt ja heitetty pois, eikä pesuliuos kuivunut täysin.Jäännössuolat ja orgaaniset liuottimet ovat haitallisia myöhemmälle käänteistranskriptiolle ja PCR:lle.Eriasteinen esto, joten kudoslysaatti tulee poistaa kokonaan uuttoprosessin aikana ja pesun tulee olla riittävää, jotta putken ympäröivät seinämät voidaan pestä.Lisäksi putken tyhjennys ja puhallus on välttämätön vaihe, joka vähentää entisestään orgaanisen aineen jäännöstä.
Lisätietoja RNA-uutosta saat verkkosivuiltamme:
www.foreivd.com saadaksesi lisätietoja.
Postitusaika: 1.12.2022
