Olemme olleet kokeneita valmistaja.Voittaa enemmistön markkinoidensa tärkeistä sertifikaateista Big Discounting China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, laatu on tehtaan elämää, keskittyminen asiakkaiden kysyntään on yrityksen selviytymisen ja kehityksen lähde, Noudatamme rehellisyyttä ja hyvässä uskossa työskentelevää asennetta, odotamme innolla saapumistasi!
Olemme olleet kokeneita valmistaja.Voittaa enemmistön markkinoidensa tärkeistä sertifikaateistaChina Taq DNA -polymeraasi, Qpcr, Yrityksemme lupaa: kohtuulliset hinnat, lyhyt tuotantoaika ja tyydyttävä huoltopalvelu, toivotamme sinut myös tervetulleeksi käymään tehtaallamme milloin tahansa haluat.Toivon, että meillä on nyt miellyttävä ja pitkäaikainen yhteistyö!!!

Kuvaukset

Tämä pakkaus käyttää ainutlaatuista lyysipuskurijärjestelmää, joka voi nopeasti vapauttaa RNA:ta viljellyistä solunäytteistä RT-qPCR-reaktioita varten, mikä eliminoi aikaa vievän ja työlän RNA:n puhdistusprosessin.RNA-templaatti voidaan saada vain 7 minuutissa.Sarjan mukana toimitetut 5×Direct RT Mix- ja 2×Direct qPCR Mix-SYBR -reagenssit voivat saada nopeasti ja tehokkaasti reaaliaikaisia ​​kvantitatiivisia PCR-tuloksia.

5×Direct RT Mixillä ja 2×Direct qPCR Mix-SYBR:llä on vahva inhibiittoritoleranssi, ja näytteiden lysaattia voidaan käyttää mallina suoraan RT-qPCR:lle.Tämä pakkaus sisältää ainutlaatuisen RNA:n korkeaaffiniteetin Foregene-käänteistranskriptaasin ja Hot D-Taq DNA -polymeraasin, dNTP:t, MgCl:n₂, reaktiopuskuri, PCR-optimoija ja stabilointiaine.

Tekniset tiedot

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Sarjan komponentit

Ominaisuudet ja edut

■ Yksinkertainen ja tehokas: Cell Direct RT -tekniikalla RNA-näytteet voidaan saada vain 7 minuutissa.

■ Näytteen tarve on pieni, jopa 10 solua voidaan testata.

■ Suuri suorituskyky: se pystyy nopeasti havaitsemaan RNA:n soluista, joita on viljelty 384-, 96-, 24-, 12- ja 6-kuoppalevyillä.

■ DNA Eraser voi nopeasti poistaa vapautuneet genomit, mikä vähentää huomattavasti vaikutusta myöhempien kokeiden tuloksiin.

■ Optimoitu RT- ja qPCR-järjestelmä tekee kaksivaiheisesta RT-PCR-käänteistranskriptiosta tehokkaampaa ja PCR:stä spesifisemmän ja vastustuskykyisemmän RT-qPCR-reaktion estäjille.

Kit-sovellus

Soveltamisala: viljellyt solut.

- Näytteen lyysillä vapautunut RNA: koskee vain tämän pakkauksen RT-qPCR-templaattia.

- Sarjaa voidaan käyttää seuraaviin tarkoituksiin: geenien ilmentymisanalyysi, siRNA-välitteisen geenin hiljennysvaikutuksen todentaminen, lääkeseulonta jne.

Kaavio

Varastointi ja säilyvyys

Tämän sarjan osa I tulee säilyttää 4 ℃:ssa;Osa II tulee säilyttää -20 ℃:ssa.

Foregene Protease Plus II tulee säilyttää 4 ℃:ssa, ei saa jäätyä -20 ℃:ssa.

Reagenssi 2×Direct qPCR Mix-SYBR tulee säilyttää -20 ℃:ssa pimeässä;Jos sitä käytetään usein, se voidaan säilyttää myös 4 ℃:ssa lyhytaikaista varastointia varten (käytä 10 päivän kuluessa). Olemme kokeneet valmistajan.Voittaa enemmistön markkinoidensa tärkeistä sertifikaateista suurelle alennukselle China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Laatu on tehtaan elämää, Keskittyminen asiakkaiden kysyntään on yrityksen selviytymisen ja kehityksen lähde, Noudatamme rehellisyyttä ja hyvässä uskossa työskentelevää asennetta, odotamme innolla saapumistasi!
Iso alennusChina Taq DNA -polymeraasi, Qpcr, Yrityksemme lupaa: kohtuulliset hinnat, lyhyt tuotantoaika ja tyydyttävä huoltopalvelu, tervetuloa myös vierailemaan tehtaallamme milloin tahansa.Toivon, että meillä on nyt miellyttävä ja pitkäaikainen yhteistyö!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Luett.nro.DRT-01021/01022

Solusuoralle RT-qPCR:lle käyttäen ≤ 1000 000 solua

Tuotteen esittely

Tämä tuote käyttää ainutlaatuista lyysipuskurijärjestelmää RNA:n nopeaan vapauttamiseen viljellyistä solunäytteistä RT-qPCR-reaktioita varten, mikä eliminoi aikaa vievän ja työlän RNA:n puhdistusprosessin ja vain 7 minuuttia tarvittavan RNA-templaatin saamiseksi. 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman tuottaa reaaliaikaisia ​​ja kvantitatiivisia tuloksia nopeasti ja nopeasti.

5× Direct RT Mix ja 2× Direct qPCR Mix-Taqman sietävät hyvin inhibiittoria, ja ne voivat suorittaa tehokkaan käänteisen ja spesifisen monistuksen käyttämällä mitattavan näytteen lysaattia templaattina.Reagenssi sisältää Foregene-käänteistranskriptaasia, Hot D-Taq DNA -polymeraasia, dNTP:itä, MgCl:a₂, reaktiopuskuri, PCR-optimoija ja stabilisaattori, joita voidaan käyttää lyysipuskurin kanssa näytteiden nopeaan ja helposti havaitsemiseen, ja joilla on korkea herkkyys, spesifisyys ja stabiilisuus.

Tuotteen ominaisuudet

Yksinkertainen ja tehokas Cell Direct RT -tekniikka, jolla RNA-näytteiden saaminen kestää vain 7 minuuttia.

Näytetarpeet ovat pienet, ja kokeisiin voidaan käyttää vähintään 10 viljeltyä solua.

Suuri suorituskyky nopeaan RNA:n hankkimiseen viljellyistä soluista, kuten 384-, 96-, 24-, 12- ja 6-kuoppalevyistä.

DNA Eraser pystyy nopeasti poistamaan vapautuneet genomit, mikä vähentää huomattavasti vaikutusta myöhempien kokeiden tuloksiin.

Optimoidut RT- ja qPCR-järjestelmät mahdollistavat kaksivaiheisen RT-PCR:n tehokkaammalla käänteistranskriptiolla, spesifisyydellä ja vahvemmalla RT-qPCR-reaktion estäjän sietokyvyllä.

Kit-sovellus

Soveltamisala: Viljellyt solut.

Näytteen lyysi tulkittu RNA: käytetty vain kaksivaiheisena RT-qPCR-templaattina.

Kittejä voidaan käyttää seuraaviin tarkoituksiin: geenin säätelyekspressioanalyysi, alleelitestaus, lääkeseulonta jne.

Sarjan rajoitukset

Monistetut fragmentit ≤ 300 bp.

Kittejä käytetään tuoreiden solujen viljelemiseen.

Tuotteiden laadunvalvonta

FOREGENEN kokonaislaadunhallintajärjestelmän mukaan jokainen Cell Direct RT-qPCR -sarjan sarja testataan tiukasti useita kertoja, jotta varmistetaan kunkin sarja-erän laadun luotettavuus ja vakaus.

Sarjan sisältö

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman voidaan ostaa erikseen, lisätietoja on liitteessä 1 (SIVU 13).

Varastointiolosuhteet

1. Toimitusehdot

Koko prosessi matalan lämpötilan jääpakkauslaatikon kuljetusprosessissa, jotta varmistetaan, että sarja on <4 °C:n tilassa.

2. Varastointiolosuhteet

Säilytä osa I 4°C:ssa ja osa II -20°C:ssa.

Foregene Protease Plus II tulee säilyttää 4 °C:ssa, ei jäädytetty -20 °C:ssa.

Reagenssi 2× Direct qPCR Mix-Taqman säilytetään -20°C:ssa tai 4°C:ssa lyhytaikaista käyttöä varten, jos sitä käytetään usein (10 päivän sisällä).

Pakkauksen komponenttien tiedot

Puskuri CL: Tarjoaa ympäristön, joka tarvitaan solujen hajoamisreaktioihin.

Puskuri ST: Lopettaa aktiivisen aineen lysaatissa välttääkseen vaikutukset myöhempään RT:hen.

DNA Eraser: DNA-poistaja, genomin poistamisen vaikutus seuraaviin kokeisiin.

5× Direct RT Mix: Sisältää korkean RNA-affiniteetin Foregene-käänteistranskriptaasia, RNaasi-inhibiittoria, dNTP:itä, stabilaattoreita, tehostajia, optimoijia ja käänteistranskription alukkeita optimaaliseen kohdistukseen (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Pohjuste).

Foregene Protease Plus II: Hajotuspuskurin yhteydessä solut hajotetaan nukleiinihappojen vapauttamiseksi.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Tämä reagenssi sisältää Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaktiopuskuri, PCR-optimoija ja stabilointiaine.

20× ROX-referenssiväri: Käytetään yleisesti ABI:n, Stratagenen ja muiden yritysten reaaliaikaisissa PCR-monistusinstrumenteissa. Sitä käytetään PCR-putkien ja PCR-annostusvirheiden aiheuttamien putkien välisen eron säätämiseen.Eri instrumenteille vaadittava 20× ROX Reference Dye -konsentraatio on erilainen, ja käyttäjä voi lisätä sitä instrumentin suositellun pitoisuuden mukaan.

RNaasi-vapaa ddH₂O: RNaasi-vapaa steriloitu ultrapuhdas vesi kaksivaiheisiin RT-qPCR-reaktioihin.

Varotoimenpiteet:(Muista lukea varotoimet huolellisesti ennen sarjan käyttöä)

Kiinnitä huomiota kokeen toimintatapaan, jotta vältetään näytteiden välinen ristikontaminaatio.

Kiinnitä huomiota koeympäristön ja välineiden puhtauteen välttääksesi RNaasikontaminaation ja RNA:n hajoamisen.

Ota tuoreita tai hyvin säilyneitä solunäytteitä äläkä koskaan käytä toistuvia pakaste-sulatettuja solunäytteitä.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqmanin tulee välttää toistuvaa jäädytystä ja sulatusta, muuten se vaikuttaa käänteistranskriptioon ja PCR:n tehokkuuteen.

Prepaannoksetennenoperaatio

Muista lukea ohjeet huolellisesti ennen tämän sarjan käyttöä.Cell Direct RT-qPCR Kit on yksinkertainen, kätevä ja nopea käyttää, ja ohjeet tarjoavat täydelliset tiedot koko sarjasta ja sen oikeasta käytöstä.Valmistele tarvittavat koemateriaalit ja laitteet ennen käyttöä.

Kokeelliset materiaalit ja laitteet

◆ Viljelysolut.

◆ 1,5 ml tai 2 ml, RNaasi-/DNaasi-vapaa sentrifugiputki, RNaasi-/DNaasi-vapaa kärki, 0,2 ml steriili qPCR-putki.

◆ qPCR-kone, pipetti, pöytäsentrifugi (≥13 400×g) (riippuen kokeellisista tarpeista) jne.

Turvallisuus

◆ Tämä tuote on tarkoitettu vain tieteelliseen tutkimustarkoituksiin, älä käytä sitä farmaseuttisiin, kliinisiin, elintarvike- tai kosmeettisiin tarkoituksiin.

◆ Kun käytät kemikaaleja, käytä asianmukaisia ​​laboratoriovaatteita, käsineitä, suojalaseja jne.

Operaatiooppaita

Cell Lysis -järjestelmät, RT-järjestelmät ja qPCR-reaktioliuoksen lisäpakkaukset voidaan ostaa erikseen, lisätietoja on liitteessä 1 (SIVU 13).

Käyttöopas

V: Näytteen RNA:n vapautuminen

1. Solut esikäsiteltiin: Pese soluviljelylevy kylmällä PBS:llä, sitten lyysaa solut (10-10⁶), 10⁶ kuin solujen määrä, suositellaan Foregene the Cell an RNA Isolation Kit Total (DE-03111) tai Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) RNA:n uuttamista ja puhdistusta varten.

1.1.Kiinnittyneet solut (esimerkiksi 24-kuoppainen levy)

1.1.1.Määritä kunkin kuopan solujen lukumäärä, määritä, että solujen lukumäärä on 1 × 10⁵ja poista elatusaine viljelymaljasta pipetillä.

1.1.2.Lisää 200 μl esijäähdytettyä 1 × PBS:ää kuhunkin kuoppaan.Älä pipetoi toistuvasti ja poista PBS kuopista.Kallista levyä ja poista niin paljon PBS:ää kuin mahdollista.Siirry vaiheeseen 2.

1.1.3.Erilainen soluviljelymalja tai viitenumerotaulukko 1-1 soluviljelymaljassa lisättiin esijäähdytettynä 1 x PBS:ää solujen pesua varten.

Taulukko 1-1: PBS-annostus eri solumäärille

Huomautus：Vahvojen kiinnittyvien solujen varmistamiseksi，suuri määrä soluhäviöitä vältetään pesussa.

1.2.Suspensiosolut tai kiinnittyneet solut, joita viljellään ei-huokoisilla levyillä

1.2.1.Muilla kuin monikuoppaisilla levyillä viljellyt kiinnittyneet solut (suspensiosolut alkavat seuraavasta vaiheesta 1.2.2), kerätään ja erotetaan solut normaalin solunkeräysmenetelmän mukaisesti ja asetetaan viljelylevyyn tai sentrifugiputkeen;jos käytetään trypsinointia, vaatia sentrifugointia solujen keräämiseksi ja jäännöstrypsiinin poistamiseksi, lisätty PBS:llä uudelleensuspendoituja soluja yksittäisiin soluihin solujen dispergoimiseksi.

1.2.2.Laskettujen solujen lukumäärän jälkeen solut jaettiin eriin 1 x 10⁵ yksi sentrifugointiputkiin, kerätään solut sentrifugoimalla 1000 x g 10 minuutin ajan.

1.2.3.Lisää 200 μl PBS:ää sentrifugiputkeen, älä pipetoi toistuvasti ja ime PBS suoraan.siirry vaiheeseen 2. (Jos saostaminen on vaikeaa ja solut suspendoitiin uudelleen, voidaan suorittaa 1000 x g sentrifugoitu 10 minuuttia supernatantin hävittämisen jälkeen, solupelletti siirry vaiheeseen 2)

2. Solujen lyysi: Poista puskuri CL, jonka lämpötila on tasapainotettu huoneenlämpötilaan, DNA Eraser ja Foregene Protease Plus II, seuraavan taulukon 1-2 mukaisesti valmistettu lyysijärjestelmä: (Lyysiliuos on käyttövalmis).

Taulukko 1-2: pilkkominen järjestelmän valmistelu (Huom: valmistelussa jäällä)

3. (24-kuoppainen levy esimerkkinä) Pipetoi 200 μl solulyysin perusseosta jokaiseen kuoppaan, puhalla toistuvasti 5-10 kertaa, inkuboi huoneenlämmössä (20-25 ℃) 5 minuuttia.

Huomautus：Kuplien muodostumisen välttämiseksi pipetoinnin aikana pipetin asteikko säädettiin 200 μl:aan tai pienemmäksi.Solut voivat näyttää sameilta lyysin jälkeen, mikä on normaalia.

4. (esimerkiksi 24-kuoppalevy) lisätään nesteeseen 20 μl puskuria ST (eri lyysijärjestelmät Puskuri ST lisätty taulukossa 1-3 esitetyssä määrässä), toistettu pipetointi 5-10 kertaa, huoneenlämpötilassa (20-25 ℃) inkuboitiin 2 minuuttia.

Huomautus：Pipetin kärki asetettiin pinnan alle varmistaen, että lysaatti lisättiin，kuplien muodostumisen välttämiseksi pipetoinnin aikana pipetin asteikko säädettiin arvoon 200 μl tai vähemmän.

Taulukko 1-3：Lisää puskuri ST

5. Lysaattia käytetään myöhemmissä RT-qPCR-kokeissa.Jos seuraavia kokeita ei voida suorittaa ajoissa, pidä sitä jäissä enintään 2 tuntia ja säilytä -20 ℃ tai -80 ℃ (enintään kolme kuukautta).

B: RT-järjestelmän valmistelu

1.Ota 5 × Direct RT Mix ulos ja aseta se jäähauteeseen, anna sen sulaa luonnollisesti ja sekoita varovasti myöhempää käyttöä varten;Ota RNase-Free ddH2O pois ja sulata se ja aseta se jäähauteeseen myöhempää käyttöä varten.Valmistele reaktiojärjestelmä jäällä alla olevan taulukon 2-1 mukaisesti.

Taulukko 2-1: RT-reaktiojärjestelmän valmistus

2. Kun järjestelmäformulaatio on valmis, sekoita varovasti ja sentrifugoi lyhyesti seuraavassa taulukossa 2 -2 reaktioolosuhteet RT-reaktio.

Taulukko 2-2: RT Reaktiotilan asetus

3. Reaktion päätyttyä reaktiotuote asetettiin suoraan jäälle qPCR:ää varten, aseta pitkäaikaissäilytys -20 ℃ tai -80 ℃.

Huomautus: Puhdistamattoman templaatin käytöstä johtuen käänteistranskriptiotuotteessa saattaa esiintyä valkoista sakkaa.Tämä on normaali ilmiö.Sentrifugoi supernatantti välittömästi myöhempiä kokeita varten.

Tuloksena oleva RT-reaktioliuos lisätään seuraavan vaiheen reaaliaikaisiin PCR-reaktiojärjestelmiin, suositellaan lisäämistä 10-30 % reaktiosysteemistä.

C: qPCR-reaktiojärjestelmän valmistus

1. Sopiva määrä B:tä valmistettu vaiheessa cDNA-templaatti seuraavan taulukon 3-1 mukaisesti reaktiojärjestelmän valmistamiseksi.

Huomautus: cDNA-templaatin määrä on 10-30 % qPCR-järjestelmästä.Lisää esimerkiksi 20 μl qPCR-järjestelmään 2-6 μl lyysipuskuria, mutta enintään 6 μl.

2. Hyvät qPCR-olosuhteet (pariutumislämpötila jne.) qPCR-reaktiolle (Reaktio-olosuhteet taulukossa 3-2).

Huomautus: Yritä käyttää optimoituja olosuhteita qPCR-reaktioihin saadaksesi parempia tuloksia.

Taulukko 3-1: PCR-reaktiojärjestelmän valmistus

1*: Alukkeen konsentraatiota voidaan säätää välillä 50-900 nM, kun alukereaktion suorituskyky on huono.

Huomautus: qPCR-järjestelmää voidaan säätää kokeellisten tarpeiden ja fluoresenssisyklilaitteen mallin mukaan.qPCR:lle 50:ssäμl järjestelmässä, säädä reagenssin annostus suhteessa 20μl järjestelmä.

2*: Valitse sopiva ROX-referenssivärin lopullinen pitoisuus fluoresenssin kvantitatiivisen lämpösyklilaitteen mukaan.Sopivimmat ROX-referenssiväripitoisuudet tavallisille kvantitatiivisille fluoresenssisyklilaitteille on esitetty alla olevassa taulukossa:

Taulukko 3-2: qPCR-reaktio-olosuhteet esitetään

Huomautus: Parhaan qPCR-vaikutuksen saavuttamiseksi voidaan käyttää gradientti-PCR:ää optimoimaan reaktio-olosuhteet eri templaateille ja eri alukkeille.PCR-reaktio-olosuhteet vaihtelevat riippuen fluoresenssianalysaattorista, templaatista, alukkeesta jne. Tietyssä toiminnassa optimaaliset reaktio-olosuhteet on suunniteltava kvantitatiivisen fluoresenssin lämpösyklilaitteen erityisolosuhteiden, templaatin tyypin, kiinnostavan fragmentin koon, monistetun fragmentin emässekvenssin ja GC-sisällön sekä alukkeiden pituuden mukaan, mukaan lukien pariutumislämpötila, reaktioaika jne.

Reaaliaikainen PCR-alukkeen suunnitteluperiaatteet

Forward Primer ja Reverse Primer

Reaaliaikaisessa PCR:ssä alukkeen suunnittelu on erittäin tärkeää.Alukkeet liittyvät PCR-monistuksen spesifisyyteen ja tehokkuuteen, ja ne voidaan suunnitella seuraavien periaatteiden mukaisesti:

◆ Pohjusteen pituus: 18-30 bp.

◆ GC-pitoisuus: 40-60 %.

◆ Tm-arvo: Primer-suunnitteluohjelmisto, kuten Primer 5, voi antaa pohjamaalin Tm-arvon.Ylävirran ja alavirran alukkeiden Tm-arvojen tulisi olla mahdollisimman lähellä.Myös Tm-laskentakaavaa voidaan käyttää: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR:ää suoritettaessa pariutumislämpötilaksi valitaan yleensä lämpötila, joka on alle alukkeen Tm-arvon 5 °C (vastaava pariutumislämpötilan nousu voi lisätä PCR-reaktion spesifisyyttä).

◆ Alukkeet ja PCR-tuotteet:

◆ Suunnittelualukkeen PCR-monistustuotteen pituus on edullisesti 100-150 bp.

◆ Suunnittelupohjamaaleja mallin toissijaisessa rakennealueella tulee välttää mahdollisimman paljon.

◆ Vältä kahden tai useamman komplementaarisen emäksen muodostumista ylävirran ja alavirran alukkeiden 3′-päiden väliin.

◆ Primer 3′ -liitinpohjaa ei voi olla läsnä 3 ylimääräisellä peräkkäisellä G:llä tai C:llä.

◆ Itse alukkeilla ei voi olla komplementaarisia rakenteita, muuten muodostuu hiusneularakenne, joka vaikuttaa PCR-monistukseen.

◆ ATCG tulee jakaa mahdollisimman tasaisesti alukesekvenssissä, ja 3′-terminaalista kantaa tulee välttää T:nä.

Liite1：Cell SuoraRT-qPCR Sarjan komponenttit lisäpaketti

1. Soluhajotusliuos