On hyvin tunnettua, että keskeisessä dogmassa RNA on transkription välittäjä DNA:n ja proteiinin ilmentymisen välillä.DNA:n havaitsemiseen verrattuna RNA:n havaitseminen voi objektiivisemmin heijastaa geenien ilmentymistä organismeissa.RNA:ta koskevat kokeet sisältävät: qRT-PCR, RNA-Seq ja fuusiogeenin havaitseminen jne. Itse RNA:n ominaisuuksien perusteella (RNA:n sokerirenkaassa on yksi vapaa hydroksyyliryhmä enemmän kuin DNA:n sokerirenkaassa) yhdistettynä suureen määrään ympäristössä olevia RNaaseja, RNA on epävakaampi ja helpommin hajoava kuin DNA.Roskaa sisään, roskat ulos, jos RNA:n laatu ei ole hyvä, niin kokeellisten tulosten täytyy olla epätyydyttäviä, erityisesti ilmentyen virheellisinä tiedoina tai huonona toistettavuutena.Siksi RNA:n käsittelyyn tulisi kiinnittää enemmän huomiota, ja laadunvalvonnan linkki on myös tärkeämpi myöhempien kokeellisten tietojen tarkkuuden ja tarkkuuden varmistamiseksi.

RNA:n laadunvalvontaan käytetään yleensä seuraavia yleisesti käytettyjä menetelmiä:

• Spektrofotometria
• agaroosigeelielektroforeesi
• Agilent Bioanalyzer
• reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR
• Qubit fluoresoiva väriainemenetelmä

01 Spektrofotometria

RNA:ssa on konjugoituja kaksoissidoksia ja sen absorptiohuippu on aallonpituudella 260 nm.Lambert-Beerin lain mukaan voimme laskea RNA-konsentraation absorptiohuipusta 260 nm:ssä.Lisäksi voimme myös laskea RNA:n puhtauden 260nm, 280nm ja 230nm absorptiohuippujen suhteen mukaan.280 nm ja 230 nm ovat proteiinien ja pienten molekyylien absorptiohuippuja.Hyväksytyn RNA:n puhtauden A260/A280 ja A260/A230 suhteen tulisi olla suurempi kuin 2. Jos se on alle 2, se tarkoittaa, että RNA-näytteessä on proteiini- tai pienmolekyylikontaminaatiota ja se on puhdistettava uudelleen.Saastumislähteet vaikuttavat alavirran kokeisiin, kuten estävät PCR-reaktioiden monistustehokkuutta, mikä johtaa epätarkkoihin kvantitatiivisiin tuloksiin.RNA:n puhtaudella on suuri vaikutus tuleviin tuloksiin, joten spektrofotometria on yleensä välttämätön laadunvalvontalinkki nukleiinihappokokeiden ensimmäisessä vaiheessa.

Kuva 1. Tyypillinen RNA/DNA-absorptiospektri

02 Agaroosigeelielektroforeesi

Puhtauden lisäksi RNA:n eheys on myös yksi tärkeimmistä indikaattoreista RNA:n laadun arvioinnissa.RNA:n hajoaminen johtaa suureen määrään lyhyitä fragmentteja näytteessä, joten niiden RNA-fragmenttien määrä, jotka voidaan tehokkaasti havaita ja peittää vertailusekvenssillä, vähenee.RNA:n eheys voidaan tarkistaa kokonais-RNA:n elektroforeesilla 1 % agaroosigeelissä.Tällä menetelmällä voit määrittää geelin itse tai käyttää esivalmistettua E-Gel™ -järjestelmää eheyden testaamiseen.Yli 80 % kokonais-RNA:sta on ribosomaalista RNA:ta, josta suurin osa koostuu 28S- ja 18S-rRNA:sta (nisäkäsjärjestelmissä).Hyvälaatuisessa RNA:ssa näkyy kaksi ilmeistä kirkasta palkkia, jotka ovat 28S ja 18S kirkkaita pylväitä, vastaavasti, 5 Kb ja 2 Kb, ja suhde on yleensä lähellä 2:1.Jos se on hajanaisessa tilassa, se tarkoittaa, että RNA-näyte on saattanut hajota, ja on suositeltavaa käyttää myöhemmin kuvattua menetelmää RNA:n laadun edelleen testaamiseen.

Kuva 2. Hajonneen (kaista 2) ja ehjän RNA:n (kaista 3) vertailu agaroosigeelielektroforeesilla

03 Agilent Bioanalyzer

Edellä kuvatun agaroosigeelielektroforeesimenetelmän lisäksi, joka voi auttaa meitä tunnistamaan RNA:n eheyden yksinkertaisesti ja nopeasti, voimme myös käyttää Agilent-bioanalysaattoria RNA:n eheyden määrittämiseen.Se käyttää mikrofluidiikan, kapillaarielektroforeesin ja fluoresenssin yhdistelmää RNA:n pitoisuuden ja eheyden arvioimiseksi.Käyttämällä sisäänrakennettua algoritmia RNA-näytteen profiilin analysointiin, Agilent bioanalyzer voi laskea referenssi-RNA-eheysarvon, RNA Integrity Number (jäljempänä RIN) [1].Mitä suurempi RIN-arvo on, sitä suurempi on RNA:n eheys (1 on erittäin huonontunut, 10 on täydellisin).Jotkut RNA:ta koskevat kokeet ehdottavat RIN:n käyttöä laadun arvioinnin parametrina.Esimerkkinä korkean suorituskyvyn sekvensointikokeet (jäljempänä NGS) ovat Oncomine™ Human Immune Repertoire -ohjelman ohjeet, joita käytetään B-solu- ja T-soluantigeenireseptorien havaitsemiseen Thermo Fisherin Oncomine-paneelisarjassa, että näytteitä, joiden RIN-arvo on suurempi kuin 4, voidaan mitata tehokkaampia lukuja ja klooneja3 (Figure).Eri paneeleille on erilaisia ​​suositeltuja alueita, ja usein korkeampi RIN voi tuoda tehokkaampia tietoja.

Kuva 3, Oncomine™ Human Immune Repertoire -kokeissa, näytteet, joiden RIN on suurempi kuin 4, voivat havaita tehokkaampia lukuja ja T-soluklooneja.【2】

RIN-arvolla on kuitenkin myös joitain rajoituksia.Vaikka RIN:llä on korkea korrelaatio NGS-kokeellisten tietojen laadun kanssa, se ei sovellu FFPE-näytteille.FFPE-näytteitä on käsitelty kemiallisesti pitkään, ja uutetulla RNA:lla on yleensä suhteellisen alhainen RIN-arvo.Tämä ei kuitenkaan tarkoita, että kokeen tehokkaan datan pitäisi olla epätyydyttävä.Jotta voimme arvioida tarkasti FFPE-näytteiden laadun, meidän on käytettävä muita mittauksia kuin RIN.RIN:n lisäksi Agilent bioanalyzer voi laskea myös DV200-arvon RNA-laadun arviointiparametriksi.DV200 on parametri, joka laskee yli 200 bp:n fragmenttien osuuden RNA-näytteestä.DV200 on parempi FFPE-näytteen laadun indikaattori kuin RIN.FFPE:n uuttamalla RNA:lla on erittäin korkea korrelaatio tehokkaasti havaittavien geenien määrän ja geenien monimuotoisuuden kanssa [3].Vaikka DV200 voi korjata FFPE:n laadun havaitsemisen puutteet, Agilent-bioanalysaattori ei silti pysty analysoimaan kattavasti RNA-näytteiden laatuongelmia, mukaan lukien sitä, onko näytteissä inhibiittoreita.Inhibiittorit itse voivat vaikuttaa loppupään kokeiden vahvistustehokkuuteen ja vähentää hyödyllisen datan määrää.Jotta tiedämme, onko näytteessä inhibiittoria, voimme käyttää seuraavaksi kuvattua reaaliaikaista fluoresoivaa kvantitatiivista PCR-menetelmää.

04 reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR

Reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR-menetelmä ei voi ainoastaan ​​havaita inhibiittoreita näytteestä, vaan myös heijastaa tarkasti RNA:n laatua FFPE-näytteessä.Agilentin biologisiin analysaattoreihin verrattuna reaaliaikaiset fluoresenssin kvantitatiiviset laitteet ovat suositumpia suurimmissa biologisissa laboratorioissa niiden laajemman käyttökohteen vuoksi.RNA-näytteiden laadun testaamiseksi meidän tarvitsee vain ostaa tai valmistaa alukekoettimia sisäisille vertailugeeneille, kuten GUSB (luettelonro Hs00939627).Käyttämällä tätä alukkeiden, koettimien ja standardien sarjaa (kokonais-RNA tunnetulla pitoisuudella) absoluuttisten kvantitatiivisten kokeiden suorittamiseen, tehokas RNA-fragmentin pitoisuus voidaan laskea RNA-laadun arviointistandardiksi (lyhyesti funktionaalinen RNA-kvantitaatio (FRQ)).NGS-testissä havaitsimme, että RNA-näytteiden FRQ:lla on erittäin korkea korrelaatio tehokkaan datamäärän kanssa.Kaikille näytteille, jotka ovat suurempia kuin 0,2 ng/uL FRQ, vähintään 70 % lukemista voi tehokkaasti kattaa vertailusekvenssin (kuva 4).

Kuvassa 4 fluoresenssikvantitatiivisella menetelmällä havaitulla FRQ-arvolla on erittäin korkea korrelaatio (R2>0,9) NGS-kokeessa saatujen tehokkaiden tietojen kanssa.Punainen viiva on FRQ-arvo, joka on yhtä suuri kuin 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Sen lisäksi, että reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-menetelmä soveltuu FFPE-näytteisiin, sillä voidaan myös tehokkaasti seurata inhibiittoreita näytteissä.Voimme lisätä havaittavan näytteen reaktiojärjestelmään sisäisellä positiivisella kontrollilla (IPC) ja sen määrityksellä, ja sitten suorittaa fluoresenssikvantifioinnin Ct-arvon saamiseksi.Jos Ct-arvo on jäljessä Ct-arvosta reaktiossa ilman näytettä, se osoittaa, että inhibiittori on läsnä näytteessä ja estää monistustehokkuutta reaktiossa.

05 Qubit fluoresoiva väriainemenetelmä

Qubit Fluorometer on yleisimmin käytetty pieni nukleiinihappopitoisuuden ja puhtauden havaitsemiseen tarkoitettu laite, joka on helppokäyttöinen ja löytyy lähes jokaisesta molekyylibiologian laboratoriosta.Se laskee tarkasti nukleiinihappopitoisuuden havaitsemalla ja nukleiinihappoa sitovan fluoresoivan väriaineen (Qubit-tunnistusreagenssi).Qubitilla on korkea herkkyys ja spesifisyys, ja se voi määrittää RNA:n tarkasti pg/µL-pitoisuuteen asti.Sen lisäksi, että Thermo Fisherin uusin uusi malli, Qubit 4.0, pystyy havaitsemaan RNA:n eheyden, sen lisäksi, että se pystyy mittaamaan tarkasti nukleiinihappopitoisuuden.Qubit 4.0:n RNA-tunnistusjärjestelmä (RNA IQ Assay) havaitsee RNA:n eheyden havaitsemalla samanaikaisesti kaksi spesifistä fluoresoivaa väriainetta.Nämä kaksi fluoresoivaa väriainetta voivat sitoutua RNA:n suuriin fragmentteihin ja pieniin fragmentteihin, vastaavasti.Nämä kaksi fluoresoivaa väriainetta osoittavat suurten RNA-fragmenttien osuuden näytteessä, ja tästä voidaan laskea RNA:n laatua edustava IQ-arvo (Integrity and Quality).IQ-arvoa voidaan soveltaa sekä FFPE- että ei-FFPE-näytteisiin, ja sillä on suuri vaikutus myöhempään sekvensoinnin laatuun.Esimerkkinä NGS-kokeet, Ion torrent™ -alustalla suoritetuissa RNA-Seq-testikokeissa useimmilla näytteillä, joiden IQ-arvot olivat suurempia kuin 4, oli vähintään 50 % tehokkaat lukemat (kuva 5).Verrattuna edellä mainittuihin havaitsemismenetelmiin, Qubit IQ Assay ei ole vain mukavampi käyttää ja kestää vähemmän aikaa (viiden minuutin sisällä), vaan sillä on myös suuri korrelaatio mitatun parametrin IQ-arvon ja loppupään kokeiden tietojen laadun välillä.

Kuvassa 5 on suuri korrelaatio Qubit RNA IQ -arvon ja RNA-Seq:n kartoitettujen lukujen välillä.【5】

Yllä olevan johdannon kautta uskon, että jokaisella on riittävä ymmärrys erilaisista RNA-laadunvalvontamenetelmistä.Käytännössä voit valitavastaava menetelmä näytetyypin ja olemassa olevien instrumenttien mukaan.Vain kontrolloimalla RNA:n laatua hyvin voimme välttää myöhempien kokeiden epäonnistumisen, joka johtuu huonosta näytteen laadusta, mikä säästää arvokasta aikaa, energiaa ja kustannuksia.

Referenssituotteet:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

viittauksia

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et ai.RIN: RNA:n eheysnumero eheysarvojen määrittämiseksi RNA-mittauksille.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire -käyttöopas (julkaisunro MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived from Archival Formaliini Fixed Paraffin Embedded Tissue Samples sivut 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/