RT-qPCR-koe sisältää RNA:n uuttamisen ja laadun arvioinnin, käänteisen transkription ja qPCR:n kolme vaihetta, jokaisessa vaiheessa on paljon varotoimia, esittelemme yksityiskohtaisesti alla.

Ⅰ.RNA:n laadun arviointi

RT-qPCR-kokeessa RNA:n uuton päätyttyä on arvioitava RNA:n laatu, ja seurantakoe voidaan suorittaa vasta sen jälkeen, kun se on hyväksytty.Arviointimenetelmiä ovat spektrofotometri, Agilent-geelielektroforeesi, Agilent 2100 -analyysi, joista yleisimmin käytetty spektrofotometri ja agaroosigeelielektroforeesimenetelmän tunnistus.On huomattava, että näitä kahta menetelmää on käytettävä yhdessä RNA-konsentraation, puhtauden ja eheyden havaitsemisen ja analyysin suorittamiseksi loppuun RNA:n laadun varmistamiseksi.

Aiheeseen liittyvä RNA-eristyspakkaus: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Erittäin puhdistettua ja korkealaatuista kokonais-RNA:ta voidaan saada erilaisista viljellyistä soluista 11 minuutissa.

Animal Total RNA Isolation Kit

Poimi nopeasti ja tehokkaasti erittäin puhdasta ja laadukasta kokonais-RNA:ta erilaisista eläinkudoksista.

Spektrofotometri:

Spektrofotometriä käytetään pääasiassa RNA:n pitoisuuden ja puhtauden määrittämiseen, mutta se ei pysty havaitsemaan RNA:n ja genomijäännöksen eheyttä.Niistä A260/280 ja A260/230 ovat tärkeitä parametreja RNA:n puhtauden havaitsemiseksi, ja RNA:n puhtaus voidaan havaita niiden arvojen vaihtelun mukaan:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, mikä osoittaa, että RNA:n puhtaus on hyvä;A260/280 < 1,9, mikä osoittaa, että RNA:ssa saattaa olla proteiinijäämiä;A260/280>2.1, mikä osoittaa RNA:n mahdollisen osittaisen hajoamisen, mikä voidaan edelleen vahvistaa agaroosigeelielektroforeesilla.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, mikä osoittaa, että RNA:n puhtaus on hyvä;A260/230< 2,0, mikä osoittaa, että RNA:ssa saattaa olla orgaanisten reagenssien jäämiä, kuten fenoleja, etanolia tai sokereita.

Agaroosigeelielektroforeesi:

Agaroosigeelielektroforeesimääritys voi analysoida RNA:n eheyttä, genomi- ja proteiinijäännöksiä, mutta se ei voi määrittää tarkasti RNA:n pitoisuutta tai havaita orgaanisten reagenssien jäämiä.Otetaan esimerkiksi eukaryoottiset RNA-mallit:

1. RNA:lle suoritettiin agaroosigeelielektroforeesi.Jos geelikartalla oli vain kolme yksittäistä 28sRNA:n, 18sRNA:n ja 5,8sRNA:n vyöhykettä, se osoittaa, että uutettu RNA on ehjä.Jos esiintyy vetoilmiötä, se osoittaa RNA:n osittaista hajoamista.

2. Jos liimareiän ja 28sRNA-vyöhykkeen välissä on yksi kirkas nauha, siinä saattaa olla genomisen DNA:n jäännös.

3. Jos liimareikään ilmestyy juovia, se tarkoittaa, että siinä saattaa olla proteiini- ja muiden makromolekyylisten aineiden jäämiä.

Ⅱ. Käänteinen transkriptio

Kun RNA:n uutto on valmis, se on käännettävä cDNA:ksi myöhempiä kokeita varten, joten käänteinen vaihe on välttämätön.Käänteistranskriptio otetaan käyttöön käänteistranskriptaasin ja alukkeen valinnasta:

Käänteisen transkriptaasin valinta:

Tyypillisiä käänteisiä transkriptaaseja ovat AMV RTase ja MMLV RTase.AMV RTase:n RNaasi H:lla on voimakas aktiivisuus, lyhyt synteesipituus, pieni synteesimäärä ja hyvä lämpöstabiilisuus (42 ~ 55 ℃).MMLV RTase:n RNaasi H -aktiivisuus on heikko, synteesipituus on pitkä, synteesin määrä suuri ja lämpöstabiilisuus huono (37 ~ 42 ℃).

Koska RNaasi H -entsyymin tehtävänä on hajottaa RNA-templaatti, MMLV, jolla on heikko RNaasi H -aktiivisuus, tulisi ensisijaisesti valita käänteistranskription aikana, ja myöhemmän geenitekniikan jälkeen MMLV:n lämpöstabiilius on saavuttanut kvalitatiivisen harppauksen.Foregenen ottaminenForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV käänteistranskriptioon) esimerkkinä se on uusi käänteiskopioija, jota ekspressoidaan E. colin muokatuissa bakteereissa käyttäen geneettistä rekombinaatioteknologiaa.Se on yhdistelmä-DNA-polymeraasi, joka syntetisoi komplementaarisen DNA-juosteen yksijuosteisesta RNA:sta, DNA:sta tai RNA:DNA-hybridistä.Sillä ei ole RNaasi H -aktiivisuutta, vahva stabiilisuus, vahva RNA-affiniteetti ja korkea havaitsemisherkkyys.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV käänteistranskriptioon)

Pohjamaalin valinta:

Yleensä RT-alukkeet jaetaan kolmeen luokkaan: oligo dT, satunnaiset alukkeet ja geenispesifiset alukkeet.Valitse sopivat pohjamaalit käytettäväksi erilaisten kokeellisten vaatimusten mukaan.

1. Jos templaatti on eukaryoottista alkuperää ja myöhäistä cDNA:ta käytetään rutiininomaiseen PCR-monistukseen, suositellaan Oligoa (dT);Jos seuraavaa koetta käytetään vain qPCR:ään, Oligoa (dT) suositellaan sekoittamaan satunnaisten alukkeiden kanssa käänteistranskription tehokkuuden parantamiseksi.

2. Jos templaatti on peräisin prokaryooteista, satunnaisalukkeet tai geenispesifiset alukkeet tulisi valita käänteistranskriptioon.

Ⅲ.qPCR

Fluoresenssin kvantitointia kehitetään pääasiassa kvantitatiivisten menetelmien, alukkeen suunnitteluperiaatteiden, ROX-valinnan, reaktiojärjestelmän konfiguraation ja reaktio-olosuhteiden asettamisen jne. perusteella.

Kvantitatiivisten menetelmien valinta:

Kvantitatiiviset menetelmät jaetaan suhteellisiin kvantitatiivisiin menetelmiin ja absoluuttisiin kvantitatiivisiin menetelmiin.Suhteellisen kvantifioinnin avulla voidaan havaita tiettyjen hoitomenetelmien vaikutus geeniekspressioon, havaita geenien ilmentymisen ero eri aikoina ja vertailla geenien ilmentymisen eroja eri kudoksissa.Absoluuttinen kvantifiointi voi havaita viruksen nukleiinihapon määrän ja niin edelleen.Kokeita tehdessämme meidän on valittava sopivat kvantitatiiviset menetelmät omien kokeidemme mukaan.

Pohjamaalin suunnitteluperiaatteet:

QPCR:n alukkeen suunnittelu liittyy suoraan amplifikaatiotehokkuuteen ja tuotespesifisyyteen.Siksi hyvien alukkeiden oikea suunnittelu on onnistuneen qPCR:n ensimmäinen askel.Pohjamaalin suunnittelussa tulee kiinnittää huomiota seuraaviin periaatteisiin, kun täytetään tavanomaisen pohjamaalisuunnittelun periaate:

1. Kohdefragmentin pituutta säädetään välillä 100 - 300 bp;

2. Ristieksonisuunnittelu genomisen DNA:n vaikutuksen välttämiseksi;

3. Suunniteltujen alukkeiden monistustehokkuus on testattava, ja vain kun monistusteho saavuttaa standardin (90-110 %), niitä voidaan käyttää kvantitatiivisiin kokeisiin;

4. Alukkeen konsentraatio on yleensä optimoitu välillä 0,1 uM - 1,0 uM.

ValikoimaROX:

Kvantitatiivisen reaktion prosessissa ROX voi säätää tasaisesti haihtumisen ja kondensaation aiheuttamaa optista polkueroa, pipetointivirhettä tai tilavuuseroa, mikä parantaa tulosten toistettavuutta.On kuitenkin huomattava, että ROX:n valinta liittyy instrumenttiin.Jos qPCR-laitteella on toiminto, joka korjaa automaattisesti reikien välisen eron, sen ei tarvitse lisätä ROXia;muuten siihen on lisättävä ROX-korjaus.Pienten yhteistyökumppaneiden tulee ostaa reagensseja oikean ROX:n valinnassa käytetyn laitteen mukaan, jotta vältytään myöhemmiltä virheiltä.

Reaktiojärjestelmän valmistus:

20 ul:n ja 50 ul:n reaktiotilavuudet ovat edullisia.Seuraaviin asioihin tulee kiinnittää huomiota järjestelmää laadittaessa:

1. Reaktiojärjestelmä on valmisteltava tuuletuksella erittäin puhtaassa työpöydässä, uusi ddH₂O:ta käytetään jokaisessa kokeessa;

2. Jokaisen kokeen on valmisteltava NTC sen tarkistamiseksi, onko järjestelmässä saasteita, ja jokaisen alukkeen parin on suoritettava NTC järjestelmää valmisteltaessa;

3. Sen havaitsemiseksi, onko RNA-templaatissa gDNA-tähdettä, jokaiselle näytteelle voidaan valmistaa NRT havaitsemista varten;

4. Järjestelmää valmisteltaessa on suositeltavaa tehdä vähintään 3 teknistä toistoa yhdelle näytteelle;

5. Kun templaatti on cDNA, on suositeltavaa laimentaa 5-10 kertaa käänteistranskriptiojärjestelmän estovaikutuksen vähentämiseksi qPCR-kokeessa.Mallin määrää on parempi tutkia gradientin mukaan, jotta CT-arvo putoaa välille 20-30;

6. Määritä tarvittava määrä reaktioita, lisää 5-10 % reaktioiden lukumäärän perusteella ja laske tilavuuskonfiguraatioluku;

7, järjestelmä valmistetaan käyttämällä esisekoitusperiaatetta, sekoittamalla sentrifugoinnin jälkeen ja varmistamalla, ettei kuplia muodostu;

8, Mahdollisuuksien mukaan valita tukitarvikkeet.

Aiheeseen liittyvä RT-qPCR Kit