Fluoresenssikvantitatiivinen PCR (tunnetaan myös nimellä TaqMan PCR, jäljempänä FQ-PCR) on PE (Perkin Elmer) Yhdysvalloissa vuonna 1995 kehittämä uusi nukleiinihappojen kvantitatiivinen tekniikka. Tämä tekniikka perustuu tavanomaiseen PCR:ään lisäämällä fluoresoivasti merkittyjä koettimia.Verrattuna joustavaan PCR:ään, FQ-PCR:llä on monia etuja kvantitatiivisen funktionsa toteuttamisessa.Tämän artikkelin tarkoituksena on kuvata lyhyesti tekniikan ominaisuuksia, periaatteita, menetelmiä ja sovelluksia.
1 Ominaisuudet
FQ-PCR:llä ei ole vain tavallisen PCR:n korkea herkkyys, vaan myös fluoresoivien koettimien käytön ansiosta se pystyy suoraan havaitsemaan fluoresoivan signaalin muutoksen PCR-monistuksen aikana valosähköisen johtumisjärjestelmän kautta kvantitatiivisten tulosten saamiseksi, mikä voittaa monet tavanomaisen PCR:n puutteet, joten sillä on myös DNA-hybridisaatiotekniikan korkea spesifisyys ja korkea spesifisyys.
Esimerkiksi yleisiä PCR-tuotteita on tarkkailtava agaroosigeelielektroforeesilla ja etidiumbromidivärjäyksellä ultraviolettivalolla tai polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja hopeavärjäyksellä.Tämä ei vaadi vain useita välineitä, vaan vie myös aikaa ja vaivaa.Käytetyt tahrat Etidiumbromidi on haitallista ihmiskeholle, ja nämä monimutkaiset kokeelliset toimenpiteet tarjoavat mahdollisuuksia saastumiselle ja väärille positiivisille tuloksille.FQ-PCR:n on kuitenkin avattava kansi vain kerran näytteen lataamisen aikana, ja seuraava prosessi on täysin suljetun putken toiminta, joka ei vaadi PCR-jälkikäsittelyä, mikä välttää monia haittoja tavanomaisissa PCR-operaatioissa.Kokeessa käytetään yleensä PE-yhtiön kehittämää ABI7100 PCR -lämpösyklilaitetta.
Laitteessa on seuraavat ominaisuudet: ① Laaja sovellus: Sitä voidaan käyttää DNA- ja RNA-PCR-tuotteiden kvantifiointiin, geeniekspression tutkimukseen, patogeenien havaitsemiseen ja PCR-olosuhteiden optimointiin.② Ainutlaatuinen kvantitatiivinen periaate: Käytettäessä fluoresoivasti leimattuja koettimia fluoresenssin määrä kertyy PCR-syklin mukana laservirityksen jälkeen, jotta kvantifioinnin tarkoitus saavutetaan.③ Korkea työteho: Sisäänrakennettu 9600 PCR-lämpösyklilaite, tietokoneohjattu 1-2 tuntia 96 näytteen automaattisen ja synkronisen vahvistuksen ja kvantifioinnin suorittamiseksi.④ Geelielektroforeesia ei tarvita: näytettä ei tarvitse laimentaa ja elektroforeesia, käytä vain erityistä anturia havaitsemaan suoraan reaktioputkessa.⑤ Ei saastumista putkilinjassa: Ainutlaatuinen täysin suljettu reaktioputki ja valosähköinen johtamisjärjestelmä on otettu käyttöön, joten saastumisesta ei tarvitse huolehtia.⑥Tulokset ovat toistettavissa: kvantitatiivinen dynaaminen alue on jopa viisi suuruusluokkaa.Siksi tämän tekniikan menestyksekkäästä kehittämisestä lähtien monet tieteelliset tutkijat ovat arvostaneet sitä ja sitä on sovellettu monilla aloilla.
2 Periaatteet ja menetelmät
FQ-PCR:n toimintaperiaate on käyttää Taq-entsyymin 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuutta fluoresoivasti leimatun koettimen lisäämiseksi PCR-reaktiojärjestelmään.Koetin voi spesifisesti hybridisoitua alukesekvenssin sisältämän DNA-templaatin kanssa.Koettimen 5'-pää on leimattu fluoresenssiemissiogeenillä FAM (6-karboksifluoreseiini, fluoresenssin emissiohuippu 518 nm:ssä) ja 3'-pää on leimattu fluoresenssin sammutusryhmällä TAMRA (6-karboksitetrametyylirhodamiini, 6-karboksitetrametyylirhodamiini, fluoresenssin 5-prosentsointi8). on fosforyloitu koettimen pidentymisen estämiseksi PCR-monistuksen aikana.Kun koetin pysyy ehjänä, sammuttajaryhmä vaimentaa emittoivan ryhmän fluoresenssiemission.Kun emittoiva ryhmä on erotettu sammutusryhmästä, esto poistetaan ja optinen tiheys 518 nm:ssä kasvaa ja havaitaan fluoresenssin havaitsemisjärjestelmällä. Renaturaatiovaiheessa koetin hybridisoituu templaatti-DNA:n kanssa, ja pidennysvaiheessa oleva Taq-entsyymi liikkuu DNA-templaattia pitkin alukkeen jatkeella.Kun anturi katkaistaan, sammutusvaikutus vapautuu ja fluoresoiva signaali vapautuu.Joka kerta kun mallia kopioidaan, anturi katkaistaan, ja samalla vapautuu fluoresoiva signaali.Koska vapautuneiden fluoroforien määrän ja PCR-tuotteiden lukumäärän välillä on yksi-yhteen suhde, tätä tekniikkaa voidaan käyttää templaatin tarkkaan kvantifiointiin.Kokeellisessa instrumentissa käytetään yleensä PE-yhtiön kehittämää ABI7100 PCR -lämpösyklilaitetta, ja myös muita lämpökiertolaitteita voidaan käyttää.Jos kokeessa käytetään ABI7700-reaktiotyyppistä reaktiojärjestelmää, reaktion päätyttyä kvantitatiiviset tulokset voidaan antaa suoraan tietokoneanalyysin avulla.Jos käytät muita lämpösyklilaitteita, sinun on käytettävä fluoresenssidetektoria mittaamaan fluoresenssisignaali reaktioputkessa samanaikaisesti laskeaksesi RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ edustaa näyteputken fluoresoivan emissioryhmän luminesenssin intensiteetin suhdetta sammutusryhmän luminesenssin intensiteettiin, RQ- edustaa näiden kahden suhdetta tyhjässä putkessa, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) edustaa CR:n kvantitatiivisen datan muutoksen aikana saatujen tulosten määrää.Fluoresoivien koettimien käyttöönoton ansiosta kokeen spesifisyys paranee merkittävästi.Koettimen suunnittelun tulee yleensä täyttää seuraavat ehdot: ①Koettimen pituuden tulee olla noin 20-40 emästä sitoutumisen spesifisyyden varmistamiseksi.②GC-emästen pitoisuus on 40-60 % yksittäisten nukleotidisekvenssien päällekkäisyyden välttämiseksi.③ Vältä hybridisaatiota tai päällekkäisyyttä alukkeiden kanssa.④ Koettimen ja templaatin välisen sitoutumisen stabiilisuus on suurempi kuin alukkeen ja templaatin välisen sitoutumisen stabiilisuus, joten koettimen Tm-arvon tulee olla vähintään 5°C korkeampi kuin alukkeen Tm-arvon.Lisäksi koettimen konsentraatio, koettimen ja templaattisekvenssin välinen homologia sekä koettimen ja alukkeen välinen etäisyys vaikuttavat kaikki koetuloksiin.
Liittyvät tuotteet:
Kiina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman valmistaja ja toimittaja |Foregene (foreivd.com)
Postitusaika: 15.10.2021
