RT-qPCR on kehitetty tavallisesta PCR-tekniikasta.Se lisää fluoresoivia kemikaaleja (fluoresoivia väriaineita tai fluoresoivia koettimia) perinteiseen PCR-reaktiojärjestelmään ja havaitsee PCR-pariutumis- ja pidennysprosessin reaaliajassa niiden erilaisten luminesenssimekanismien mukaisesti.Fluoresoivan signaalin muutoksia väliaineessa käytetään tuotteen muutoksen määrän laskemiseen jokaisessa PCR-syklissä.Tällä hetkellä yleisimmät menetelmät ovat fluoresoiva väriainemenetelmä ja koetinmenetelmä.

Fluoresoiva väriainemenetelmä:
Jotkin fluoresoivat väriaineet, kuten SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO jne., eivät säteile valoa itsestään, mutta lähettävät fluoresenssia sitoutuessaan dsDNA:n pienempään uraan.Siksi kone ei pysty havaitsemaan fluoresoivaa signaalia PCR-reaktion alussa.Kun reaktio etenee pariutumis-pidennysvaiheeseen (kaksivaiheinen menetelmä) tai pidennysvaiheeseen (kolmivaiheinen menetelmä), kaksoisjuosteet avautuvat tässä vaiheessa ja uusi DNA-polymeraasi Säikeisynteesin aikana fluoresoivat molekyylit yhdistyvät dsDNA:n pienempään uraan ja emittoivat fluoresenssia.PCR-syklien määrän kasvaessa yhä useammat väriaineet yhdistyvät dsDNA:n kanssa, ja myös fluoresoiva signaali paranee jatkuvasti.Otetaan esimerkkinä SYBR Green Ⅰ.
Anturin menetelmä:
Taqman-koetin on yleisimmin käytetty hydrolyysikoetin.Anturin 5′-päässä on fluoresoiva ryhmä, yleensä FAM.Koetin itsessään on kohdegeenille komplementaarinen sekvenssi.Fluoroforin 3′-päässä on fluoresoiva sammutusryhmä.Fluoresenssiresonanssin energiansiirron periaatteen mukaan (Förster resonance energy transfer, FRET), kun reportteri fluoresoiva ryhmä (luovuttajafluoresoiva molekyyli) ja sammuttava fluoresoiva ryhmä (akseptorifluoresoiva molekyyli) Kun viritysspektri on päällekkäinen ja etäisyys on hyvin lähellä (7-10 nm) luovuttajan fluoresenssimolekyylin akseptoinnissa. ule, kun taas autofluoresenssi on heikentynyt.Siksi PCR-reaktion alussa, kun koetin on vapaa ja ehjä järjestelmässä, reportterifluoresoiva ryhmä ei lähetä fluoresenssia.Hehkutuksen aikana aluke ja koetin sitoutuvat malliin.Pidennysvaiheen aikana polymeraasi syntetisoi jatkuvasti uusia ketjuja.DNA-polymeraasilla on 5′-3′-eksonukleaasiaktiivisuutta.Kun DNA-polymeraasi saavuttaa koettimen, se hydrolysoi koettimen templaatista, erottaa reportterifluoresoivan ryhmän sammuttajafluoresoivasta ryhmästä ja vapauttaa fluoresoivan signaalin.Koska koettimen ja mallineen välillä on yksi-yhteen suhde, koetinmenetelmä on värjäysmenetelmää parempi testin tarkkuuden ja herkkyyden suhteen.

Kuva 1 qRT-PCR:n periaate

Pohjamaalisuunnittelu
Periaatteet:

Alukkeet tulisi suunnitella nukleiinihapposarjan konservoituneelle alueelle ja niillä on oltava spesifisyys.

On parasta käyttää cDNA-sekvenssiä, ja myös mRNA-sekvenssi on hyväksyttävä.Jos ei, ota selvää DNA-sekvenssin cds-alueen suunnittelusta.
Fluoresoivan kvantitatiivisen tuotteen pituus on 80-150 bp, pisin on 300 bp, alukkeen pituus on yleensä 17-25 emästä, ja eron ylävirran ja alavirran alukkeiden välillä ei pitäisi olla liian suuri.

G+C-pitoisuus on 40-60 % ja 45-55 % on paras.
TM-arvo on 58-62 astetta.
Pyri välttämään alukedimeerejä ja itsedimeerejä, (ei näy enempää kuin 4 paria peräkkäisiä komplementaarisia emäksiä) hiusneularakenne, jos se on väistämätöntä, tee ΔG<4,5kJ/mol* Jos et pysty varmistamaan, että gDNA on poistettu käänteistranskription aikana Clean, on parasta suunnitella alukkeet intronista, rikasta′-aluetta ei voida välttää, TC-aluetta ei voida välttää *3. /C, A/G jatkuvan rakenteen (2-3) alukkeet ja ei-
spesifinen Heterogeenisesti monistetun sekvenssin homologia on edullisesti alle 70 % tai sillä on 8 komplementaarisen emäksen homologia.
Tietokanta:
CottonFGD haku avainsanoilla
Pohjamaalisuunnittelu:
IDT-qPCR-alukkeen suunnittelu

Kuva 2 IDT online-pohjamaalien suunnittelutyökalusivu

Kuva 3 tulossivun näyttö
LncRNA-alukkeiden suunnittelu:
lncRNA:samat vaiheet kuin mRNA.
miRNA:Stem-loop -menetelmän periaate: Koska kaikki miRNA:t ovat lyhyitä noin 23 nt:n sekvenssejä, suoraa PCR-detektiota ei voida suorittaa, joten käytetään stem-loop -sekvenssityökalua.Varsi-silmukkasekvenssi on noin 50 nt:n yksijuosteinen DNA, joka voi muodostaa itsestään hiusneularakenteen.3 'Pää voidaan suunnitella miRNA:n osafragmentille komplementaariseksi sekvenssiksi, sitten kohde-miRNA voidaan liittää kantasilmukkasekvenssiin käänteistranskription aikana ja kokonaispituus voi olla 70 bp, mikä on linjassa qPCR:llä määritetyn monistetun tuotteen pituuden kanssa.Tailing miRNA alukkeen suunnittelu .
Vahvistuskohtainen tunnistus:
Online-räjähdystietokanta: CottonFGD-räjäytys sekvenssin samankaltaisuuden mukaan
Paikallinen räjähdys: Katso Blast+:n käytöstä paikallisen blastin tekemiseen, linux ja macot voivat luoda suoraan paikallisen tietokannan, win10-järjestelmä voidaan tehdä myös ubuntu bashin asentamisen jälkeen.Luo paikallinen räjähdystietokanta ja paikallinen räjähdys;avaa ubuntu bash win10:ssä.
Huomautus: Ylämaan puuvilla ja merisaaren puuvilla ovat tetraploidisia viljelykasveja, joten räjäytyksen tuloksena on usein kaksi tai useampia tulitikkuja.Aiemmin käyttämällä NAU cd:itä tietokantana räjähdyksen suorittamiseen todennäköisesti löydetään kaksi homologista geeniä, joissa on vain muutama SNP-ero.Yleensä kahta homologista geeniä ei voida erottaa alukesuunnittelulla, joten niitä käsitellään samana.Jos on ilmeinen indel, aluke on yleensä suunniteltu indelille, mutta tämä voi johtaa alukkeen sekundaarirakenteeseen. Vapaa energia kasvaa, mikä johtaa amplifikaatiotehokkuuden laskuun, mutta tämä on väistämätöntä.

Pohjusteen sekundaarirakenteen havaitseminen:
Askeleet:avaa oligo 7 → syötä mallisarja → sulje aliikkuna → tallenna → etsi aluke mallista, paina ctrl+D asettaaksesi alukkeen pituuden → analysoi erilaisia ​​toissijaisia ​​rakenteita, kuten itsedimeroituva runko, heterodimeeri, hiusneula, epäsopivuus jne. Kuvan 4 kaksi viimeistä kuvaa ovat alukkeiden testituloksia.Etupohjamaalin tulos on hyvä, siinä ei ole selvää dimeeri- ja hiusneularakennetta, ei jatkuvia komplementaarisia emäksiä, ja vapaan energian absoluuttinen arvo on alle 4,5, kun taas takapohjustus näyttää jatkuvaa. 6 emästä ovat toisiaan täydentäviä ja vapaa energia on 8,8;lisäksi vakavampi dimeeri ilmestyy 3′-päähän ja 4 peräkkäisen emäksen dimeeri ilmestyy.Vaikka vapaa energia ei ole korkea, 3′-dimeeri Chl voi vaikuttaa vakavasti amplifikaatiospesifisyyteen ja vahvistustehokkuuteen.Lisäksi on tarpeen tarkistaa hiusneulojen, heterodimeerien ja yhteensopimattomuuksien varalta.

Kuvio 3 oligo7-ilmaisutulokset
Vahvistuksen tehokkuuden tunnistus:
PCR-reaktion monistustehokkuus vaikuttaa vakavasti PCR-tuloksiin.Myös qRT-PCR:ssä amplifikaatiotehokkuus on erityisen tärkeä kvantitatiivisten tulosten kannalta.Poista muut aineet, koneet ja protokollat ​​reaktiopuskurista.Alukkeiden laadulla on myös suuri vaikutus qRT-PCR:n amplifikaatiotehokkuuteen.Tulosten tarkkuuden varmistamiseksi sekä suhteellisen fluoresenssin kvantifioinnin että absoluuttisen fluoresenssin kvantifioinnin on havaittava alukkeiden monistustehokkuus.Tunnustetaan, että tehokas qRT-PCR-monistuksen tehokkuus on välillä 85 % - 115 %.On kaksi tapaa:
1. Vakiokäyrämenetelmä:
a.Sekoita cDNA
b.Gradienttilaimennus
c.qPCR
d.Lineaarinen regressioyhtälö vahvistustehokkuuden laskemiseksi
2. LinRegPCR
LinRegPCR on ohjelma reaaliaikaisten RT-PCR-tietojen analysointiin, jota kutsutaan myös kvantitatiiviseksi PCR-tiedoksi (qPCR), joka perustuu SYBR Greeniin tai vastaavaan kemiaan.Ohjelma käyttää ei-perusviivakorjattuja tietoja, suorittaa perusviivakorjauksen jokaiselle näytteelle erikseen, määrittää lineaarisuuden ikkunan ja käyttää sitten lineaarista regressioanalyysiä suoran viivan sovittamiseksi PCR-tietojoukon läpi.Tämän viivan kaltevuuden perusteella lasketaan kunkin yksittäisen näytteen PCR-tehokkuus.Keskimääräistä PCR-tehokkuutta amplikonia kohden ja Ct-arvoa näytettä kohti käytetään laskettaessa lähtökonsentraatio näytettä kohti, ilmaistuna mielivaltaisina fluoresenssiyksiköinä.Tietojen syöttö ja tulostus tapahtuu Excel-taulukon kautta.Vain näyte
sekoitus vaaditaan, ei gradienttia
vaiheet vaaditaan:(Otetaan esimerkkinä Bole CFX96, ei aivan kone, jossa on selkeä ABI)
koe:se on tavallinen qPCR-koe.
qPCR-datan lähtö:LinRegPCR voi tunnistaa kaksi erilaista tulostustiedostoa: RDML tai kvantifiointivahvistustulos.Itse asiassa se on koneen syklin numeron ja fluoresenssisignaalin reaaliaikainen tunnistusarvo, ja vahvistus saadaan analysoimalla lineaarisen segmentin tehokkuuden fluoresenssin muutosarvo.
Tietojen valinta: Teoriassa RDML-arvon pitäisi olla käyttökelpoinen.On arvioitu, että tietokoneeni ongelmana on se, että ohjelmisto ei tunnista RDML:ää, joten minulla on excelin lähtöarvo alkuperäisenä datana.On suositeltavaa suorittaa ensin tietojen karkea seulonta, kuten näytteiden lisäämisen epäonnistuminen jne. Pisteet voidaan poistaa lähtötiedoista (ei tietenkään voi poistaa niitä, LinRegPCR jättää nämä kohdat huomiotta myöhemmässä vaiheessa)

Kuva 5 qPCR-tietojen vienti

Kuva 6 ehdokasnäytteiden valinta

Datan syöttö:Avaa pätevyysvahvistuksen tulokset.xls, → avaa LinRegPCR → tiedosto → lue excelistä → valitse parametrit kuvan 7 mukaisesti → OK → napsauta Määritä perusviivat

Kuva 7 linRegPCR-tietojen syöttämisen vaiheet

Tulos:Jos toistoa ei ole, ryhmittelyä ei tarvita.Jos esiintyy toistoa, ryhmittelyä voidaan muokata näyteryhmittelyssä ja geenin nimi syötetään tunnisteeseen, jolloin sama geeni ryhmitetään automaattisesti.Napsauta lopuksi tiedostoa, vie excel ja tarkastele tuloksia.Jokaisen kuopan vahvistustehokkuus ja R2-tulokset näytetään.Toiseksi, jos jaat ryhmiin, korjattu keskimääräinen vahvistusteho näytetään.Varmista, että kunkin alukkeen amplifikaatiotehokkuus on 85–115 %.Jos se on liian suuri tai liian pieni, se tarkoittaa, että alukkeen amplifikaatiotehokkuus on huono.

Kuva 8 Tulos ja datatulostus

Kokeellinen prosessi:
RNA:n laatuvaatimukset:
Puhtaus:1.72,0 osoittaa, että isotiosyanaattia saattaa olla jäljellä.Puhtaan nukleiinihapon A260/A230 tulisi olla noin 2 . Jos absorptio on voimakas 230 nm:ssä, se osoittaa, että siinä on orgaanisia yhdisteitä, kuten fenaatti-ioneja.Lisäksi se voidaan havaita 1,5 % agaroosigeelielektroforeesilla.Osoita merkkiä, koska ssRNA:lla ei ole denaturaatiota ja molekyylipainologaritmilla ei ole lineaarista suhdetta, eikä molekyylipainoa voida ilmaista oikein.Keskittyminen: Teoreettisestieialle 100 ng/ul, jos pitoisuus on liian alhainen, puhtaus on yleensä alhainen, ei korkea

Kuva 9 RNA-geeli

Lisäksi, jos näyte on arvokas ja RNA-pitoisuus korkea, on suositeltavaa jakaa se eriin uuton jälkeen ja laimentaa RNA lopulliseen konsentraatioon 100-300 ng/ul käänteistranskriptiota varten.Sisäänkäänteisen transkription prosessi, kun mRNA transkriptoidaan, käänteistranskriptioon käytetään oligo- (dt)-alukkeita, jotka voivat sitoutua spesifisesti polyA-häntiin, kun taas lncRNA ja circRNA käyttävät satunnaisia ​​heksameerialukkeita (Random 6 mer) kokonais-RNA:n käänteistranskriptioon. MiRNA:lle käytetään miRNA-spesifisiä kaula-loop-alukkeita.Monet yritykset ovat nyt tuoneet markkinoille erityisiä pyrstöpakkauksia.Varsi-silmukkamenetelmässä pyrstömenetelmä on kätevämpi, tehokkaampi ja reagenssia säästävämpi, mutta saman perheen miRNA:iden erottamisen vaikutuksen ei pitäisi olla yhtä hyvä kuin varsi-silmukkamenetelmällä.Jokaisella käänteistranskriptiopakkauksella on vaatimukset geenispesifisten alukkeiden (stem-loop) konsentraatiolle.MiRNA:lle käytetty sisäinen referenssi on U6.Varsi-silmukka-inversion prosessissa U6-putki tulee kääntää erikseen ja U6:n etu- ja takapohjustus tulisi lisätä suoraan.Sekä circRNA että lncRNA voivat käyttää HKG:itä sisäisenä referenssinä.SisääncDNA-tunnistus,
jos RNA:n kanssa ei ole ongelmaa, myös cDNA:n pitäisi olla kunnossa.Jos kuitenkin pyritään kokeen täydellisyyteen, on parasta käyttää sisäistä vertailugeeniä (referenssigeeni, RG), joka pystyy erottamaan gDNA:n cd:stä.Yleensä RG on taloudenhoitogeeni., HKG), kuten on esitetty kuviossa 10;Tuolloin tein soijapavun varastoproteiinia ja käytin sisäisenä referenssinä aktiini7:ää sisältäviä introneja.Tämän alukkeen monistetun fragmentin koko gDNA:ssa oli 452 bp, ja jos cDNA:ta käytettiin templaattina, se oli 142 bp.Sitten testitulokset havaitsivat, että osa cDNA:sta oli todella gDNA:n kontaminoitunut, ja se myös osoitti, että käänteistranskription tuloksessa ei ollut ongelmaa, ja sitä voitiin käyttää templaattina PCR:ssä.On hyödytöntä ajaa agaroosigeelielektroforeesia suoraan cDNA:lla, ja se on diffuusi vyöhyke, joka ei ole vakuuttava.

Kuvio 10 cDNA-detektio

qPCR-olosuhteiden määrittäminenei yleensä ole ongelma sarjan protokollan mukaan, lähinnä tm-arvon vaiheessa.Jos jotkin alukkeet eivät ole hyvin suunniteltuja alukkeen suunnittelun aikana, mikä johtaa suureen eroon tm-arvon ja teoreettisen 60 °C:n välillä, on suositeltavaa, että cDNA Kun näytteet on sekoitettu, suorita gradientti-PCR alukkeilla ja yritä välttää lämpötilan asettamista ilman vyöhykkeitä TM-arvoksi.

Tietojen analysointi

Perinteinen suhteellisen fluoresenssin kvantitatiivinen PCR-käsittelymenetelmä on periaatteessa 2:n mukainen-ΔΔCT.Tietojenkäsittelymalli.

Liittyvät tuotteet:

Reaaliaikainen PCR helppo^TM – Taqman

Reaaliaikainen PCR helppo^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix ensimmäisen juosteen cDNA-synteesiin)

RT Easy II (Master Premix ensimmäisen juosteen cDNA-synteesiin qPCR:lle)