RT-qPCR on molekyylibiologian peruskoe, ja se on kaikkien oltava tuttuja.Se sisältää pääasiassa kolme vaihetta: RNA:n uuttaminen, käänteistranskriptio cDNA:ksi ja reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR.Ei auta, mitä tapahtuu?On todennäköistä, että siinä on ongelmakäänteistranskriptiokoe!Vaikka näyttää siltä, ​​että käänteistranskriptiokokeessa tarvitsee vain lisätä RNA:ta, dNTP:tä, alukkeita jakäänteinen transkriptaasisentrifugiputkeen ja sekoita hyvin, mutta varsinaisessa käyttöprosessissa on vielä monia yksityiskohtia, joihin on kiinnitettävä huomiota.Otetaan oppia siitä!

Kuinka arvioida RNA:n laatua?
cDNA:n saamiseksi RNA:n laatu on kriittinen!RNA:n laatu voidaan havaita pääasiassa kahdesta näkökulmasta:
(1) RNA:n eheys:RNA:n eheys voidaan varmistaa agaroosigeelielektroforeesilla. Esimerkkinä eukaryootit huomioon ottaen täydellisessä kokonais-RNA:ssa on kolme selkeää vyöhykettä, molekyylipainot suuresta pieneen ovat 28S, 18S ja 5S, ja 28S on kaksi kertaa kirkkaampi kuin 18S;jos kolme vyöhykettä voidaan nähdä, mutta vyöhyketyyppi on epäselvä tai diffuusio tarkoittaa, että RNA on osittain hajonnut.Suorita tällä hetkellä käänteinen transkriptioreaktio välittömästi ja lisää mallin syöttöä asianmukaisesti.jos vain pieni molekyylipainoinen vyöhyke tai ei mitään vyöhykettä voidaan nähdä, RNA on täysin hajotettu ja se on uutettava.Agilent 2100 osoittaa RNA:n eheyden huippudiagrammilla ja RIN-arvolla.Jos nukleiinihappo on ehjä, elektroferogrammin perusviiva on tasainen;jos nukleiinihappo on vakavasti hajonnut, perusviiva on epätasainen ja lisää hajoamispiikkejä ilmaantuu;RIN-arvo heijastaa RNA:n eheyttä, alueella 0-10, mitä suurempi arvo, sitä parempi RNA:n laatu.No, mitä korkeampi täydellisyysaste.
(2) RNA:n puhtaus:OD260/280-suhde voidaan havaita UV-spektrofotometrialla.Jos OD260/280-suhde on välillä 1,9-2,1, puhtaus on erittäin hyvä.
Jäljelle jäänyt genominen DNA voi johtaa epätarkkoihin kvantitatiivisiin tuloksiin
Kun RNA uutetaan, saamamme RNA voidaan sekoittaa genomisen DNA:n (gDNA) kanssa, jota ei ole puhdistettu.Siksi myös cDNA käänteistranskription jälkeen sekoitetaangDNA.Alavirran aikanaqPCRreaktio,cDNAja gDNA voidaan monistaa samanaikaisesti, mikä johtaa suhteellisen pieneen CT-arvoon, joten tulokset voivat olla vääristyneitä.
Joten mitä meidän pitäisi tehdä tässä tilanteessa?Foregeneehdottaa:
(1) Suorita genomin puhdistus käänteiselle RNA:lle, joka voidaan poistaa kolonniuutolla RNA-uuton aikana;
(2) Käsittele uutettu RNA DNaasillaI , mutta lopeta se EDTA:lla;
käänteistranskriptioreagenssejagenominpuhdistusmoduuleilla;

Kuinka valita alukkeet käänteistranskriptioon?
Käänteistranskriptioalukkeet vaikuttavat myös käänteistranskriptioreaktion lopputulokseen.Voit valita käänteistranskriptioon satunnaisia ​​alukkeita, Oligo dT:tä tai geenispesifisiä alukkeita kokeen erityisolosuhteiden mukaan:
(1) Tietyt transkriptit: geenispesifisiä alukkeita suositellaan;
(2) Pitkät fragmenttitranskriptit: Oligo dT/geenispesifisiä alukkeita suositellaan;
(3) Pitkän segmentin transkriptien sisäiset fragmentit: geenispesifiset alukkeet / satunnaiset alukkeet / satunnaiset alukkeet + Oligo dT.Jos seuraava qPCR-koe suoritetaan, Oligo dT:tä ei voida käyttää yksinään, koska pelkän Oligo dT:n käyttö voi aiheuttaa 3'-pään poikkeaman, mikä johtaa epätarkkoihin qPCR-koetuloksiin;
(4) miRNA: Voidaan käyttää varsi- tai pyrstöpohjamaaleja.

Kuinka monta kertaa käänteistranskriptiotuotteen cDNA tulee laimentaa kvantifiointia varten?
Käänteistranskriptiotuotteen cDNA:n saamisen jälkeen on erittäin tärkeää, kuinka monta kertaa cDNA tulee laimentaa qPCR-kokeita varten.Jos cDNA-pitoisuus on liian korkea tai liian alhainen, monistustehokkuus saattaa heikentyä.Voidaanko cDNA-pitoisuutta mitata ja miten se pitäisi tehdä?
(1) Käänteiskopioijatuotteen cDNA-konsentraatiota ei voida mitata, koska käänteiskopiointituote sisältää cDNA-tuotteen lisäksi myös käänteiskopioijajäännöspuskuria, käänteiskopioijaentsyymiä, alukkeita jne., jotka häiritsevät konsentraatiomittaustuloksia ja aiheuttavat OD260/280, OD260/23-saantoa, joten cNA-suhde ei ole totta.Tällä hetkellä jotkut ystävät sanovat, sitten mittaan pitoisuuden puhdistuksen jälkeen;Tässä Foregene haluaa muistuttaa, että cDNA:ta ei suositella puhdistettavaksi, koska käänteisellä saadun cDNA:n pituus on erilainen ja lyhyt cDNA menetetään puhdistuksessa.
(2) Mitä tehdä?Ennen qPCR-koetta cDNA:n laimennusgradientti voidaan määrittää esikokeen avulla.Esimerkki: käytä cDNA-kantaliuosta, 10-kertaista laimennusta ja 100-kertaista laimennusta mallina qPCR-kokeissa ja valitse laimennustekijä CT-arvolla välillä 18-28.

Miten miRNA:t tulisi käänteiskopioida?
miRNA on yksijuosteinen pienimolekyylinen RNA, jonka koko on noin 22 nt ja joka ei koodaa proteiinia.Lyhyen pituutensa vuoksi tavanomaisella qPCR-menetelmällä sitä on vaikea mitata suoraan, joten usein on tarpeen laajentaa miRNA:ta;yleisesti käytettyjä miRNA:n käänteistranskriptiomenetelmiä ovat varsi-silmukkamenetelmä ja pyrstömenetelmä.
Varsi-silmukkamenetelmä on laajentaa miRNA:ta lisäämällä varsi-silmukkaalukkeita.Tällä tunnistusmenetelmällä on korkeampi herkkyys ja spesifisyys, mutta havaitsemisnopeus on alhainen.Yksi käänteistranskriptio voi havaita vain yhden miRNA:n ja sisäisen referenssin;hännänlisäysmenetelmä koostuu kahdesta Se täydentyy kahden entsyymin yhteistoiminnalla, jotka ovat PolyA-polymeraasi ja käänteiskopioija.PolyA-polymeraasi on vastuussa PolyA-häntien lisäämisestä miRNA:han sen pituuden lisäämiseksi, ja käänteistranskriptaasi suorittaa käänteistranskriptioreaktion.Tällä menetelmällä on korkea havaitsemisnopeus ja se pystyy havaitsemaan useita miRNA:ita ja sisäisiä referenssejä yhdessä käänteistranskriptiossa, mutta herkkyys ja spesifisyys ovat alhaisia ​​varsisilmukkamenetelmässä.