Reaaliaikainen PCR, joka tunnetaan myös nimellä kvantitatiivinen PCR tai qPCR, on menetelmä PCR-monistustuotteiden reaaliaikaiseen seurantaan ja analysointiin.
Koska kvantitatiivisen PCR:n etuna on yksinkertainen toiminta, nopea ja kätevä, korkea herkkyys, hyvä toistettavuus ja alhainen kontaminaatioaste, sitä käytetään laajalti lääketieteellisissä testauksissa, lääkkeiden tehon arvioinnissa, geenien ilmentymistutkimuksessa, siirtogeenitutkimuksessa, geenien havaitsemisessa, patogeenien havaitsemisessa, eläinten ja kasvien havaitsemisessa., elintarviketestaukset ja muut alat.
Siten olet sitten enemmän tai vähemmän alttiina tai sinun on tiedettävä kvantitatiivisen PCR:n hallitseminen, olitpa sitten mukana biotieteiden perustutkimuksessa tai lääkeyhtiöiden, karjankasvatusyritysten, elintarvikeyhtiöiden työntekijöissä tai jopa maahantulo-poistumistarkastus- ja karanteenitoimistojen, ympäristövalvontaosastojen, sairaaloiden ja muiden yksiköiden työntekijöissä.

Reaaliaikaisen PCR:n periaate

Real Time PCR on menetelmä, jossa fluoresoivia aineita lisätään PCR-reaktiojärjestelmään ja fluoresenssisignaalin intensiteettiä PCR-reaktion prosessissa seurataan reaaliajassa kvantitatiivisella PCR-laitteella ja lopuksi kokeelliset tiedot analysoidaan ja käsitellään.

【Vahvistuskäyrä】on käyrä, joka kuvaa PCR:n dynaamista prosessia.PCR:n amplifikaatiokäyrä ei itse asiassa ole standardi eksponentiaalinen käyrä, vaan sigmoidikäyrä.

[Amplifikaatiokäyrän alustavaihe]PCR-syklien lukumäärän lisääntyessä, DNA-polymeraasin inaktivoituessa, dNTP:iden ja alukkeiden ehtyessä ja synteesireaktion estyessä reaktion sivutuotteena pyrofosfaatilla jne. PCR ei aina laajene eksponentiaalisesti.ja tulee lopulta tasangolle.

[Amplifikaatiokäyrän eksponentiaalinen kasvualue]Vaikka tasannevaihe vaihtelee suuresti, monistuskäyrän eksponentiaalisen kasvualueen tietyllä alueella toistettavuus on erittäin hyvä, mikä on erittäin tärkeää PCR:n kvantitatiivisessa analyysissä.

[Kynnysarvo ja Ct-arvo]Asetamme fluoresenssin havaitsemisen raja-arvon sopivaan kohtaan monistuskäyrän eksponentiaalisella kasvualueella, nimittäin kynnysarvon (Threshold).Kynnysarvon ja vahvistuskäyrän leikkauspiste on Ct-arvo, eli Ct-arvo viittaa jaksojen lukumäärään (Threshold Cycle), kun kynnysarvo saavutetaan.

Alla oleva kaavio osoittaa selvästi kynnysviivan ja vahvistuskäyrän, kynnyksen ja Ct-arvon välisen suhteen.

【Kuinka kvantifioida?】

Matemaattisella teorialla on todistettu, että Ct-arvolla on käänteinen lineaarinen suhde alkumallien lukumäärän logaritmiin.Reaaliaikainen PCR tarkkailee PCR-monistustuotteita reaaliajassa ja kvantifioi ne eksponentiaalisen vahvistusvaiheen aikana.

Jokaisessa PCR-syklissä DNA kasvoi eksponentiaalisesti 2 kertaa ja saavutti pian tasannen.

Olettaen, että lähtö-DNA:n määrä on A₀ n syklin jälkeen DNA-tuotteen teoreettinen määrä voidaan ilmaista seuraavasti:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Sitten mitä suurempi DNA:n alkuperäinen määrä A 0 on, sitä nopeammin monistetun tuotteen määrä saavuttaa havaitsemisarvon An, ja syklien lukumäärä An saavuttaessa on Ct-arvo.Eli mitä suurempi DNA:n alkumäärä A 0 on, sitä aikaisemmin monistuskäyrä saavuttaa huippunsa ja vastaavasti vaadittu syklien määrä n on pienempi.

Suoritamme tunnetun pitoisuuden standardin gradienttilaimennusta ja käytämme sitä templaattina reaaliaikaisessa PCR:ssä, ja sarja monistuskäyriä saadaan yhtäläisin väliajoin siinä järjestyksessä, että DNA-määrä alkaa suuremmasta pienempään.Ct-arvon ja aloitusmallien lukumäärän logaritmin välisen lineaarisen suhteen mukaan a[vakiokäyrä] voidaan luoda .

Korvaamalla tuntemattoman pitoisuuden omaavan näytteen Ct-arvo standardikäyrään voidaan saada tuntemattoman pitoisuuden omaavan näytteen alkuperäinen templaattimäärä, mikä on Real Time PCR:n kvantitatiivinen periaate.

Reaaliaikaisen PCR:n tunnistusmenetelmä

Reaaliaikainen PCR havaitsee PCR-monistustuotteet havaitsemalla fluoresenssin intensiteetin reaktiojärjestelmässä.

Fluoresoivan väriaineen upotusmenetelmän periaate】

Fluoresoivat väriaineetTB Green®, kuten TB Green®, voi sitoutua epäspesifisesti kaksijuosteiseen DNA:han PCR-järjestelmissä ja fluoresoida sitoutuessaan.

Fluoresenssin intensiteetti reaktiojärjestelmässä kasvoi eksponentiaalisesti PCR-syklien lisääntyessä.Fluoresenssin intensiteetin havaitsemisen avulla DNA:n monistumisen määrää reaktiojärjestelmässä voidaan seurata reaaliajassa ja sitten voidaan käänteisesti arvioida lähtötemplaatin määrä näytteessä.

【Fluoresoivan anturimenetelmän periaate】

fluoresoiva anturion nukleiinihapposekvenssi, jossa on fluoresoiva ryhmä 5'-päässä ja sammutusryhmä 3'-päässä, joka voi sitoutua spesifisesti templaattiin.Kun koetin on ehjä, sammutusryhmä sammuttaa fluoroforin emittoiman fluoresenssin, eikä se voi fluoresoida.Kun koetin hajoaa, fluoresoiva aine hajoaa ja emittoi fluoresenssia.

Fluoresoiva koetin lisätään PCR-reaktioliuokseen.Pariutumisprosessin aikana fluoresoiva koetin sitoutuu templaatin tiettyyn kohtaan.Pidennysprosessin aikana PCR-entsyymin 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuus voi hajottaa templaatin kanssa hybridisoituneen fluoresoivan koettimen, ja fluoresoiva aine dissosioituu fluoresenssin lähettämiseksi.Detektoimalla koettimen fluoresenssin intensiteetti reaktiojärjestelmässä voidaan saavuttaa PCR-tuotteen amplifikaatiomäärän tarkkailun tarkoitus.

【Fluoresenssin havaitsemismenetelmän valinta】

Fluoresoiva koetinmenetelmä on korvaamaton, jos sitä käytetään erottamaan sekvenssejä, joilla on korkea homologia ja suorittamaan multipleksinen PCR-detektio, kuten SNP-tyypitysanalyysi.
Muissa reaaliaikaisissa PCR-kokeissa voidaan käyttää yksinkertaista, helppoa ja edullista fluoresoivaa kimeerimenetelmää.

koettimet Vahva spesifisyys, kykenee multiplex PCR:ään

Puute

Korkeat spesifisyysvaatimukset vahvistukselle;

multipleksi-PCR:ää ei voida suorittaa Tarve suunnitella erityisiä koettimia, korkeat kustannukset;

joskus anturin suunnittelu on vaikeaa

Liittyvät tuotteet: