QPCR-kokeissa alukkeen suunnittelu on myös erittäin tärkeä linkki.Alukkeiden sopivuus vai ei, riippuu läheisesti siitä, saavuttaako monistusteho standardin, ovatko amplifioidut tuotteet spesifisiä ja onko kokeellisia tuloksia saatavilla.
Joten kuinka parantaa qPCR-alukkeen spesifisyyttä?Korkea vahvistusteho?
Tänään ohjaamme sinut suunnittelemaan qPCR-alukkeita yhdessä, ja annamme qPCR-alukkeiden suunnittelusta tulla tehokas kokeiden lore-taito.
qPCR-alukkeita suunniteltaessa kiinnitä yleensä huomiota seuraaviin seikkoihin: alukkeet tulee suunnitella mahdollisimman pitkälle intronien poikki, tuotteen pituus on 100-300 bp, Tm-arvo mahdollisimman lähellä 60°C ja ylä- ja alavirta-alukkeet mahdollisimman lähellä ja alukkeen lopun tulee olla G tai C jne.
1. Intronien ylittävien alukkeiden suunnittelu
Kun suunnitellaan qPCR-alukkeita, intronien poikki suunniteltujen alukkeiden valitseminen voi estää gDNA-templaatin monistumisen, ja tuotteet ovat kaikki peräisin cDNA:n monistuksesta, mikä eliminoi gDNA-kontaminaation vaikutuksen.
2. Pohjamaalin pituus
Alukkeen pituus on yleensä 18-30 nt, ja amplifikaatiotuotteen pituutta tulisi säätää välillä 100-300 bp niin paljon kuin mahdollista.
Jos aluke on liian lyhyt, se johtaa epäspesifiseen vahvistukseen, ja jos se on liian pitkä, se muodostaa helposti toissijaisen rakenteen (kuten hiusneularakenteen).Jos monistustuote on liian pitkä, se ei sovellu polymeraasireaktioon, mikä vaikuttaa PCR-monistuksen tehokkuuteen.
3. GC-sisältö ja Tm-arvo
Alukkeiden GC-pitoisuutta tulisi säätää välillä 40 % - 60 %.Jos se on liian korkea tai liian matala, se ei edistä reaktion käynnistämistä.Forward- ja reverse-alukkeiden GC-pitoisuuden tulee olla lähellä samaa, jotta saavutetaan sama Tm-arvo ja pariutumislämpötila.
Tm-arvon tulee olla 55-65°C niin pitkälle kuin mahdollista, yleensä noin 60°C, ja ylä- ja alavirran Tm-arvon tulisi olla mahdollisimman lähellä, mieluiten korkeintaan 4°C.
4. Vältä valitsemasta A:ta pohjamaalin 3′ päässä
Kun alukkeen 3′-pää ei täsmää, eri emästen synteesitehokkuudessa on suuria eroja.Kun viimeinen emäs on A, se voi myös käynnistää ketjusynteesin jopa yhteensopimattomuuden tapauksessa, ja kun viimeinen emäs on T When , epäsovitusinduktion tehokkuus heikkenee suuresti.Siksi yritä välttää A:n valitsemista pohjamaalin 3′-päähän, ja on parempi valita T.
Jos se on koetinaluke, koettimen 5'-pää ei voi olla G, koska vaikka yksi G-emäs on kytketty FAM-fluoresoivaan reportteriryhmään, G voi myös sammuttaa FAM-ryhmän lähettämän fluoresoivan signaalin, mikä johtaa vääriin negatiivisiin tuloksiin.Näytä.
5. Perusjakauma
Neljän emäksen jakautuminen alukkeessa on mieluiten satunnainen, välttäen yli 3 peräkkäistä G:tä tai C:tä 3'-päässä ja yli 3 peräkkäistäG tai C on helppo muodostaa pariliitos GC-rikkaalla sekvenssialueella.
6. Pohjusteen suunnittelualueen tulisi välttää monimutkaisia ​​toissijaisia ​​rakenteita.
Monistustuotteen yhden juosteen muodostama sekundäärinen rakenne vaikuttaa PCR:n sujuvaan etenemiseen.Ennustelemalla etukäteen, onko kohdesekvenssissä sekundaarirakennetta, yritä välttää tätä aluetta alukkeiden suunnittelussa.
7. Itse alukkeiden ja alukkeiden välillä tulisi yrittää välttää peräkkäisiä komplementaarisia emäksiä.
Itse alukkeen ja alukkeen välillä ei voi olla peräkkäistä 4 emäksen komplementaarisuutta.Itse alukkeella ei saa olla komplementaarista sekvenssiä, muuten se taittuu muodostaen hiusneularakenteen, mikä vaikuttaa alukkeen ja templaatin pariutumisyhdistelmään.
Ylävirran ja alavirran alukkeiden välillä ei voi olla komplementaarisia sekvenssejä.Alukkeiden välinen komplementaarisuus tuottaa alukedimeerejä, jotka heikentävät PCR:n tehokkuutta ja jopa vaikuttavat kvantitatiiviseen tarkkuuteen.Jos primer-dimeeri- ja hiusneularakenteita ei voida välttää, △G-arvo ei saa olla liian korkea (saa olla alle 4,5 kcal/mol).
8. Alukkeet vahvistavat kohdekohtaista tuotetta.
QPCR-detektion perimmäinen tavoite on ymmärtää kohdegeenin runsaus.Jos epäspesifistä vahvistusta tapahtuu, kvantifiointi on epätarkka.Siksi alukkeiden suunnittelun jälkeen ne on testattava BLAST:lla ja tuotteiden spesifisyyttä verrataan sekvenssitietokannassa.
Seuraavaksi otamme ihmisen GAS6 (Growth Arrest specific 6) -geenin esimerkkinä qPCR-alukkeiden suunnittelussa.
01 kyselygeeni
Homo GAS6NCBI:n kautta.Tässä meidän tulisi kiinnittää huomiota geenien nimen ja lajin vertailuun varmistaaksemme, että ne ovat johdonmukaisia.
02 Etsi geenisekvenssi
(1) Jos kohdesekvenssi on genominen DNA, valitse ensimmäinen, joka on geenin genominen DNA-sekvenssi.
(2) Jos kohdesekvenssi on mRNA, valitse toinen.Kun olet syöttänyt, napsauta alla olevasta taulukosta CDS.Ruskea taustasekvenssi on geenin koodaava sekvenssi.
03 Suunnittelupohjamaalit
Siirry Primer-BLAST-liitäntään
Syötä geenin järjestysnumero tai sekvenssi Fasta-muodossa vasemmassa yläkulmassa ja täytä tarvittavat parametrit.

Napsauta "Get primers" ja NCBI ponnahtaa kertomaan, että tällainen parametrivalinta vahvistetaan muihin liitosmuunnelmiin.Voimme tarkistaa eri liitosvaihtoehdot ja lähettää ne saadaksemme sopivan pohjamaaliparin (kuten alla olevasta kuvasta näkyy).Tämä prosessi voi kestää kymmeniä sekunteja.
Näiden alukeparien hehkutuslämpötilat ovat kaikki noin 60 °C.Valitse kokeen tarkoituksen mukaan alukkeet, joiden pituus on kohtalainen, spesifisyys on hyvä ja alukkeiden itsekomplementaatio on vähäistä, ja onnistumisprosentti on melko korkea!
04Alukkeen spesifisyyden tarkistus
Itse asiassa Primer-Blast voi alukkeiden suunnittelun lisäksi myös arvioida suunnittelemamme pohjamaalit.Palaa pohjamaalien suunnittelusivulle, syötä suunnittelemamme alku- ja loppupohjamaalit, niin muita parametreja ei säädetä.Lähettämisen jälkeen näet, onko alukeparia myös muissa geeneissä.Jos ne kaikki näkyvät geenissä, jota haluamme monistaa, mikä osoittaa, että tämän alukeparin spesifisyys on suuri!(Esimerkiksi tämä on alukkeen kyselyn ainoa tulos!)

05 Pohjamaalin laatuarvio
Millainen aluke on "täydellinen" aluke, jossa yhdistyvät "vahvistustehokkuus standardiin asti", "vahvistetut tuoteominaisuudet" ja "luotettavat koetulokset"?
Vahvistuksen tehokkuus

sulamiskäyrä
Alukkeiden monistustehokkuus saavuttaa 90-110 %, mikä tarkoittaa, että amplifikaatiotehokkuus on hyvä ja sulamiskäyrällä on yksi huippu ja yleensä Tm>80°C, mikä tarkoittaa, että monistusspesifisyys on hyvä.
 
Liittyvät tuotteet:
Reaaliaikainen PCR Easy – SYBR GREEN I
Reaaliaikainen PCR Easy-Taqman