RNaasi on herkkä sana, jota monet opiskelijat, jotka usein suorittavat RNA-uuttokokeita, eivät halua kuulla.Täysin aseistautuneena RNA, joka lopulta uutettiin erittäin myrkyllisillä fenoli- ja kloroformireagensseilla, hajosi.En ole sovittu!!!Katsotaanpa tänään kuuluisan Rnasen alkuperää.

Ribonukleaasi (RNaasi) tai RNaasi on nukleaasi, joka voi hydrolysoida RNA:n pieniksi molekyyleiksi.RNaasi pienimolekyylisenä proteiinina on epätavallisen stabiili .Perinteinen korkean lämpötilan ja paineen höyrysterilointi ja proteiini-inhibiittorit eivät voi täysin inaktivoida sitä.RNaasin stabiilisuus johtuu pääasiassa rakenteen disulfidisidoksista.Esimerkiksi naudan haiman yleisesti käytetyssä RNaasissa on vain 124 aminohappoa, mutta se sisältää 4 disulfidisidosta.Rikkisidos ja disulfidisidos antavat RNaasille erinomaisen lämpöstabiilisuuden.Lisäksi rnaasilla on suhteellisen pieni molekyylipaino ja se voi monissa tapauksissa palauttaa nopeasti alkuperäisen konformaationsa.

Sen lisäksi, että se on erittäin vakaa,RNaasit ovat kaikkialla laboratorioissa .RNaasi on biologinen puolustusmekanismi.Solulle eksogeeninen RNA on usein kohtalokas.Eksogeeniseen DNA:han verrattuna eksogeeninen RNA on usein vaarallisempi.RNA transkriptoidaan ja transloidaan onnellisesti, joten melkein kaikki organismit ovat kehittäneet RNaaseja puolustautumaan eksogeenisen RNA:n tunkeutumista vastaan.Siksi laboratoriossa viljellyt bakteerisolut ja sinä, joka uuttaat RNA:ta, tihkuvat RNaasin aromia.Ihmiskehon nesteet (sylki, kyyneleet jne.) sisältävät suuren määrän RNaasia, joten älä itke RNA:n hajoamisen yhteydessä.Mitä enemmän itket, sitä pahempi RNA:n hajoaminen!!Sisar Daiyu ei sovellu RNA:n erottamiseen!

Lisäksi herkkä ihosi sisältää myös paljon RNaasia, ja myös ihon koskettamat markkerit, pipetit, jääkaapin ovet ja ovenkahvat sisältävät RNaasia.

Kun on niin paljon sekaisin, katsotaanpa kuinka käsitellä RNaaseja.

Ensimmäinen asia, jonka kaikki ajattelevat poistaessaan RNA:ta, onDEPC(dietyylipyrokarbonaatti).DEPC pääasiassa denaturoi proteiinia yhdistymällä RNaasi-aktiivisen ryhmän histidiinin imidatsolirenkaaseen, mikä estää entsyymin aktiivisuutta.0,1 % DEPC:llä voi olla parempi poistovaikutus Rnaseen, mutta meidän on kiinnitettävä huomiota siihen, että DEPC on tunnettu karsinogeeni, joten sitä käytettäessä tulee kiinnittää erityistä huomiota.

RNaasin osalta meidän on aloitettava kahdesta näkökulmasta,ensimmäinen on endogeenisen RNaasin toiminnan estäminen

Perinteiset RNA-uuttoreagenssit, kuten guanidiini-isotiosyanaatti ja DTT, jotka sisältyvät Trizoliin, voivat avata RNaasin disulfidisidoksen, mutta RNaaseja on edelleen, erityisesti kudosnäytteissä, joten kiinnitä huomiota alhaiseen lämpötilaan.

1.Upota kudosnäyte välittömästi nestemäiseen typpeen sen poistamisen jälkeen tai kaupalliseen RNA-säilöntäliuokseen.

2.Uutettuasi solunäytteen RNA:n lisää se lyysiliuokseen ja lyysaa jäälaatikossa

3. Jauhamiseen on parasta käyttää nestemäistä typpeä kun kudosnäytteet homogenoidaan.Kun käytät sähköhomogenisaattoria ilman nestetyppeä, kiinnitä huomiota siihen, että homogenaattiadapteri on esijäähdytetty kokonaan.

Toinen on eksogeeninen DNaasi

1.Ole täysin aseistettu, käytä laboratoriotakkia, käytä maskia ja muista käyttää paria uusia käsineitä (älä ole niin säästäväinen!! Huomioi, että Trizol on erittäin syövyttävää, ja se on myös erittäin vahvaa käsineiden läpi, joten älä tippu käsiisi).

2.Kaikki käytetyt pipetinkärjet, EP-putket, PCR-putket ja muut laitteet on de-RNaasi-käsitelty.Se voidaan liottaa 0,1 % DEPC:ssä ja sitten paineistaa korkeassa paineessa.Kiinnitä huomiota toimintaan vetokaapissa.Paikalliset tyrannit voivat ostaa suoraan tarvikkeita entsyymien poistamiseen.

PS: Kerron teille laiskan menetelmän.Vaikka korkea lämpötila ja korkea paine eivät pysty poistamaan RNaasia kokonaan, se poistaa suuren osan siitä.2 kertaa korkealla lämpötilalla ja korkealla paineella on hyvä vaikutus, ja RNA: n uuttamisella on vain vähän vaikutusta.

3.Alkoholi voi denaturoida proteiineja,joten RNA-uuttopöytä voidaan pyyhkiä 75-prosenttisella alkoholilla , ja käsineet voidaan myös suihkuttaa alkoholilla.

4.Lopullinen RNA:n liuotusliuos ja sentrifugiputki tulee myös käsitellä de-RNaasilla.DEPC-vesi on yleisesti käytetty RNA:ta liuottava liuos.Puhutaanpa oikeasta DEPC-veden valmistusmenetelmästä (muista pakata kaupallinen DEPC uudelleen ostaessasi sitä)

Lisää DEPC ultrapuhtaan veteen suhteessa 1:1000, ravista hyvin, anna seistä yön yli 37 °C:ssa ja steriloi 121 °C:ssa korkeassa lämpötilassa ja paineessa 15 minuuttia.DEPC-vettä voidaan säilyttää -20 °C:ssa 1 ml:n erissä.

Lopuksi yhteenvetona: alhainen lämpötila on avain, kulutusosat käsitellään hyvin, täysin aseistettu ja vähemmän puhetta!

Siinä se tämän päivän strategialle.Toivotan sinulle kaikkea mainitsemaasi RNA-pitoisuutta ja puhtautta.Molemmat A260/A280 ovat 2.0!!!

Tietenkin, jos käytät ahuoneenlämmössä toimiva RNA:n uuttosarja, et ehkä kohtaa yllä olevia ongelmia.

Käyttö huoneenlämpötilassa lisäämättä DNaasia, uuttaa kokonais-RNA:ta soluista 11 minuutissa ja uuttaa kokonais-RNA:ta eläinkudoksista tai kasveista 30 minuutissa.

Kokeilunäytteitä varten ota yhteyttä:overseas@foregene.com

Liittyvät tuotteet:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/