• PCR on menetelmä, jota käytetään DNA:n monistamiseen pienestä määrästä DNA-templaattia.RT-PCR käyttää käänteistranskriptiota DNA-templaatin tuottamiseksi RNA-lähteestä, joka voidaan sitten monistaa.
• PCR ja RT-PCR ovat tyypillisesti päätepistereaktioita, kun taas qPCR ja RT-qPCR käyttävät tuotteen synteesin nopeuden kinetiikkaa PCR-reaktion aikana läsnä olevan templaatin määrän määrittämiseen.
• Uudemmat menetelmät, kuten digitaalinen PCR, tarjoavat alkuperäisen DNA-templaatin absoluuttisen kvantifioinnin, kun taas menetelmät, kuten isoterminen PCR, vähentävät kalliiden laitteiden tarvetta luotettavien tulosten saamiseksi.

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on suhteellisen yksinkertainen ja laajalti käytetty molekyylibiologian tekniikka DNA- ja RNA-sekvenssien monistamiseen ja havaitsemiseen.Verrattuna perinteisiin DNA-kloonaus- ja monistusmenetelmiin, jotka voivat kestää usein päiviä, PCR vaatii vain muutaman tunnin.PCR on erittäin herkkä ja vaatii minimaalisen templaatin spesifisten sekvenssien havaitsemiseen ja monistamiseen.Perus-PCR-menetelmät ovat edenneet yksinkertaisesta DNA:n ja RNA:n havaitsemisesta.Alla olemme antaneet yleiskatsauksen erilaisista PCR-menetelmistä ja reagensseista, joita tarjoamme Enzo Life Sciences -yrityksellä tutkimustarpeisiisi.Pyrimme auttamaan tutkijoita nopeasti saamaan PCR-reagensseja käytettäväksi seuraavassa tutkimusprojektissaan!

PCR

Tavallista PCR:ää varten tarvitset vain DNA-polymeraasin, magnesiumin, nukleotidit, alukkeet, monistettavan DNA-templaatin ja lämpösyklilaitteen.PCR-mekanismi on yhtä yksinkertainen kuin sen tarkoitus: 1) kaksijuosteinen DNA (dsDNA) denaturoidaan lämpödenaturoimalla, 2) alukkeet asettuvat yhteen yksittäisten DNA-säikeiden kanssa ja 3) DNA-polymeraasi jatkaa alukkeita, jolloin tuloksena on kaksi kopiota alkuperäinen DNA-juoste.Denaturaatio-, hehkutus- ja venymisprosessi useiden lämpötilojen ja aikojen aikana tunnetaan yhtenä vahvistusjaksona (kuva 1).

Jakson jokainen vaihe tulee optimoida käytetylle mallille ja alukesarjalle.Tämä sykli toistetaan noin 20-40 kertaa, ja sitten monistettu tuote voidaan analysoida, tyypillisesti agaroosigeelillä (kuvio 2).

Koska PCR on erittäin herkkä menetelmä ja yksittäisiin reaktioihin tarvitaan hyvin pieniä tilavuuksia, useiden reaktioiden perusseoksen valmistaminen on suositeltavaa.Pääseos on sekoitettava hyvin ja jaettava sitten reaktioiden lukumäärän mukaan varmistaen, että jokainen reaktio sisältää saman määrän entsyymiä, dNTP:itä ja alukkeita.Monet toimittajat, kuten Enzo Life Sciences, tarjoavat myös PCR-seoksia, jotka sisältävät jo kaiken paitsi alukkeet ja DNA-templaatin.

Runsaasti guaniinia/sytosiinia sisältävät (GC-rikkaat) alueet ovat haaste tavallisissa PCR-tekniikoissa.GC-rikkaat sekvenssit ovat vakaampia kuin sekvenssit, joilla on pienempi GC-pitoisuus.Lisäksi GC-rikkaat sekvenssit pyrkivät muodostamaan toissijaisia ​​rakenteita, kuten hiusneulasilmukoita.Tämän seurauksena GC-rikkaat kaksoissäikeet on vaikea erottaa kokonaan denaturaatiovaiheen aikana.Tämän seurauksena DNA-polymeraasi ei voi syntetisoida uutta juostetta esteettä.Korkeampi denaturaatiolämpötila voi parantaa tätä, ja säädöt korkeampaan pariutumislämpötilaan ja lyhyempään pariutumisaikaan voivat estää GC-rikkaiden alukkeiden epäspesifisen sitoutumisen.Lisäreagenssit voivat tehostaa GC-rikkaiden sekvenssien monistumista.DMSO, glyseroli ja betaiini auttavat hajottamaan GC-vuorovaikutuksista johtuvia sekundaarisia rakenteita ja helpottavat siten kaksoisjuosteiden erottamista.

Hot Start PCR

Epäspesifinen monistus on ongelma, joka voi ilmetä PCR:n aikana.Useimmat PCR:ssä käytetyt DNA-polymeraasit toimivat parhaiten lämpötiloissa, jotka ovat noin 68–72 °C.Entsyymi voi kuitenkin olla aktiivinen myös alemmissa lämpötiloissa, vaikkakin vähäisemmässä määrin.Lämpötiloissa, jotka ovat paljon pariutumislämpötilan alapuolella, alukkeet voivat sitoutua epäspesifisesti ja johtaa epäspesifiseen monistumiseen, vaikka reaktio järjestetään jäillä.Tämä voidaan estää käyttämällä polymeraasi-inhibiittoreita, jotka dissosioituvat DNA-polymeraasista vasta, kun tietty lämpötila on saavutettu, mistä johtuu termi hot start PCR.Inhibiittori voi olla vasta-aine, joka sitoo polymeraasin ja denaturoituu denaturaation alkulämpötilassa (tyypillisesti 95 °C).

High Fidelity -polymeraasi

Vaikka DNA-polymeraasit monistuvat melko tarkasti alkuperäiseen templaattisekvenssiin, nukleotidien yhteensovittamisessa voi tapahtua virheitä.Yhteensopimattomuudet sovelluksissa, kuten kloonauksessa, voivat johtaa typistettyihin transkripteihin ja väärin käännettyihin tai inaktiivisiin proteiineihin alavirtaan.Näiden ristiriitojen välttämiseksi polymeraasit, joilla on "oikoluku" on tunnistettu ja sisällytetty työnkulkuun.Ensimmäinen oikolukupolymeraasi, Pfu, tunnistettiin vuonna 1991 Pyrococcus furiosuksesta.Tällä Pfu-entsyymillä on 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuus.Kun DNA:ta monistetaan, eksonukleaasi poistaa yhteensopimattomat nukleotidit juosteen 3'-päästä.Sitten oikea nukleotidi korvataan ja DNA-synteesi jatkuu.Väärien nukleotidisekvenssien tunnistaminen perustuu sitoutumisaffiniteettiin oikeaan nukleosiditrifosfaattiin entsyymin kanssa, jolloin tehoton sitoutuminen hidastaa synteesiä ja mahdollistaa oikean korvaamisen.Pfu-polymeraasin oikolukuaktiivisuus johtaa vähemmän virheisiin lopullisessa sekvenssissä Taq-DNA-polymeraasiin verrattuna.Viime vuosina on tunnistettu muita oikolukuentsyymejä, ja alkuperäiseen Pfu-entsyymiin on tehty modifikaatioita, joilla vähennetään edelleen virheiden määrää DNA-monistuksen aikana.

RT-PCR

Käänteistranskriptio-PCR tai RT-PCR mahdollistaa RNA:n käytön templaattina.Lisävaihe mahdollistaa RNA:n havaitsemisen ja monistamisen.RNA käänteiskopioidaan komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA) käyttämällä käänteiskopioijaa.RNA-templaatin laatu ja puhtaus ovat olennaisia ​​RT-PCR:n onnistumisen kannalta.RT-PCR:n ensimmäinen vaihe on DNA/RNA-hybridin synteesi.Käänteistranskriptaasilla on myös RNaasi H -toiminto, joka hajottaa hybridin RNA-osan.Yksijuosteinen DNA-molekyyli täydentyy sitten käänteistranskriptaasin DNA-riippuvaisella DNA-polymeraasiaktiivisuudella cDNA:ksi.Ensimmäisen juosteen reaktion tehokkuus voi vaikuttaa monistusprosessiin.Tästä eteenpäin standardia PCR-menettelyä käytetään cDNA:n monistamiseen.Mahdollisuudella muuttaa RNA cDNA:ksi RT-PCR:llä on monia etuja, ja sitä käytetään ensisijaisesti geeniekspressioanalyysiin.RNA on yksijuosteinen ja erittäin epävakaa, mikä tekee sen kanssa työskentelystä haastavaa.Se toimii yleensä ensimmäisenä vaiheena qPCR:ssä, joka kvantifioi RNA-transkriptit biologisessa näytteessä.

qPCR ja RT-qPCR

Kvantitatiivista PCR:ää (qPCR) käytetään nukleiinihappojen havaitsemiseen, karakterisoimiseen ja kvantifiointiin useissa sovelluksissa.RT-qPCR:ssä RNA-transkriptit kvantifioidaan usein käänteistranskriptoimalla ne ensin cDNA:ksi, kuten edellä on kuvattu, ja sen jälkeen suoritetaan qPCR.Kuten tavanomaisessa PCR:ssä, DNA monistetaan kolmella toistuvalla vaiheella: denaturaatio, pariutuminen ja elongaatio.Kuitenkin qPCR:ssä fluoresoiva leimaus mahdollistaa tietojen keräämisen PCR:n edetessä.Tällä tekniikalla on monia etuja saatavilla olevien menetelmien ja kemikaalien valikoiman ansiosta.

Väriainepohjaisessa qPCR:ssä (tyypillisesti vihreä) fluoresoiva leimaus mahdollistaa monistettujen DNA-molekyylien kvantifioinnin käyttämällä dsDNA:ta sitovaa väriainetta.Kunkin syklin aikana mitataan fluoresenssi.Fluoresenssisignaali kasvaa suhteessa replikoituneen DNA:n määrään.Siksi DNA kvantifioidaan "reaaliajassa" (kuva 3).Väriainepohjaisen qPCR:n haitat ovat, että vain yksi kohde voidaan tutkia kerrallaan ja että väriaine sitoutuu mihin tahansa näytteessä olevaan ds-DNA:han.

Koetinpohjaisessa qPCR:ssä voidaan havaita useita kohteita samanaikaisesti jokaisesta näytteestä, mutta tämä edellyttää alukkeiden lisäksi käytettävän kohdekohtaisen koettimen (koettimien) optimointia ja suunnittelua.Saatavilla on useita erityyppisiä koetinmalleja, mutta yleisin tyyppi on hydrolyysikoetin, joka sisältää fluoroforin ja sammuttimen.Fluoresenssiresonanssienergian siirto (FRET) estää fluoroforin emission sammuttimen kautta, kun koetin on ehjä.PCR-reaktion aikana koetin kuitenkin hydrolysoituu alukkeen pidentämisen ja spesifisen sekvenssin, johon se on sitoutunut, monistumisen aikana.Koettimen pilkkominen erottaa fluoroforin sammuttimesta ja johtaa monistuksesta riippuvaiseen fluoresenssin kasvuun (kuvio 4).Siten fluoresenssisignaali koettimeen perustuvasta qPCR-reaktiosta on verrannollinen näytteessä olevan koettimen kohdesekvenssin määrään.Koska koetinpohjainen qPCR on spesifisempi kuin väriainepohjainen qPCR, sitä käytetään usein qPCR-pohjaisissa diagnostisissa määrityksissä.

Isoterminen vahvistus

Yllä mainitut PCR-tekniikat vaativat kalliita lämpökiertolaitteita kammion lämpötilan nostamiseksi ja laskemiseksi tarkasti denaturointi-, lämpökäsittely- ja pidennysvaiheita varten.On kehitetty useita tekniikoita, jotka eivät vaadi niin tarkkoja laitteita ja jotka voidaan suorittaa yksinkertaisessa vesihauteessa tai jopa kiinnostuksen kohteena olevissa soluissa.Näitä tekniikoita kutsutaan yhteisesti isotermiseksi vahvistukseksi, ja ne toimivat eksponentiaaliseen, lineaariseen tai kaskadivahvistukseen.

Tunnetuin isoterminen vahvistustyyppi on silmukkavälitteinen isoterminen amplifikaatio eli LAMP.LAMP käyttää eksponentiaalista monistusta 65 °C:ssa templaatti-DNA:n tai RNA:n monistamiseen.LAMP:ia suoritettaessa käytetään neljästä kuuteen kohde-DNA:n alueille komplementaarista aluketta DNA-polymeraasin kanssa uuden DNA:n syntetisoimiseksi.Kahdella näistä alukkeista on täydentäviä sekvenssejä, jotka tunnistavat sekvenssit muissa alukkeissa ja sitovat ne mahdollistaen "silmukka"-rakenteen muodostumisen äskettäin syntetisoituun DNA:han, joka sitten auttaa alukkeen pariutumista seuraavilla monistuskierroksilla.LAMP voidaan visualisoida useilla menetelmillä, mukaan lukien fluoresenssi, agaroosigeelielektroforeesi tai kolorimetria.Tuotteen läsnäolon tai puuttumisen helppous visualisointi ja havaitseminen kolorimetrialla sekä tarvittavien kalliiden laitteiden puute teki LAMPista sopivan vaihtoehdon SARS-CoV-2-testaukseen alueilla, joilla kliinisiä laboratoriotestejä ei ollut helposti saatavilla, tai näytteiden varastointiin ja kuljetukseen. ei ollut mahdollista, tai laboratorioissa, joissa ei aiemmin ollut PCR-lämpökiertolaitteita.