Perinteiset käänteiset transkriptaasit eivät siedä korkeita lämpötiloja (optimaalinen lämpötila MMLV-aktiivisuudelle on 37-50 °C ja AMV on 42-60 °C).Monimutkaisempaa virus-RNA:ta ei voida tehokkaasti käänteiskopioida cDNA:ksi matalissa lämpötiloissa, mikä johtaa havaitsemistehokkuuteen.Perinteinen RT-qPCR vaatii yleensä kahden avainentsyymin (käänteiskopioijaentsyymin ja DNA-polymeraasin) osallistumisen, mikä tekee mahdottomaksi yksinkertaistaa reaktiojärjestelmän toimintaa ja alentaa kustannuksia.Tässä esittelemme kaksi korkeita lämpötiloja kestävää käänteistranskriptaasia, TtH ja RevTaq.Näillä kahdella entsyymillä on myös DNA-polymeraasin tehtävä, joten niitä kutsutaan bifunktionaalisiksi entsyymeiksi.

TtH DNA-polymeraasi

Olet varmasti kuullut TtH:sta, joka on peräisin termofiilisestä bakteerista Thermus thermophilus HB8.Kun läsnä on kaksiarvoisia kationeja, kuten Mg2+, sillä on DNA-polymeraasiaktiivisuutta.Sitä käytetään laajalti PCR-reaktioissa, kuten Taq-entsyymissä, mutta sillä on korkeampi lämmönkestävyys kuin Taq-entsyymillä, joten sillä on myös parempi vaikutus PCR:ään korkealla GC-pitoisuudella malleilla.

· Tällä entsyymillä ei periaatteessa ole 3'→5'-eksonukleaasiaktiivisuutta eikä 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuutta, joten sitä voidaan käyttää myös dideoksisekvensointiin.

· Tällä entsyymillä on RTaasi-aktiivisuutta.Mn2+:n läsnä ollessa RTaasi-aktiivisuus voimistuu.Tätä ominaisuutta käyttämällä sitä voidaan käyttää käänteistranskriptioreaktion ja PCR-reaktion suorittamiseen samassa putkessa, eli yksivaiheisessa RT-PCR:ssä.Mn2+:n läsnä ollessa RT-PCR:n tarkkuus ei kuitenkaan ole korkea.RT-aktiivisuudella ei ole mitään tekemistä rnaasi H -aktiivisuuden kanssa.

· Tth-DNA-polymeraasin lisääntynyt aktiivisuus (pH9, optimi +55℃～+70℃, maksimi +95℃) voittaa RNA:n sekundaarirakenteen aiheuttamat ongelmat.Tuloksena oleva cDNA voidaan monistaa PCR:llä samalla entsyymillä Mg2+-ionien läsnä ollessa.

· Tth-DNA-polymeraasin kyky suorittaa käänteistranskriptio ja DNA:n monistus korkeissa lämpötiloissa tekee tästä entsyymistä käyttökelpoisen solu- ja virus-RNA:n kvantitatiivisessa RT-PCR:ssä, kloonauksessa ja geeniekspressioanalyysissä.
· Tth-DNA-polymeraasia käytetään RT-PCR:ssä RNA:n monistamiseen 1 kb:iin asti.

Ominaisuudet ja edut

Tth DNA-polymeraasi:

• Varmista optimoitu polymeraasiketjureaktion (PCR) tuotekoko, vähintään 1000 bp RT-PCR-reaktiossa

• Hyväksy modifioitu deoksiribonukleosiditrifosfaatti substraatiksi

• Ei liity RNaasi H -aktiivisuuteen

• Sillä on korkea lämpöstabiilius ongelmien ratkaisemiseksi, jotka yleensä liittyvät RNA:n korkeaan sekundaarirakenteeseen

RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi

Lämmönkestävä DNA-polymeraasi, jolla on käänteistranskriptaasiaktiivisuutta

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymeraasi on suunniteltu, erittäin lämmönkestävä, kaksitoiminen entsyymi, jolla on käänteiskopioija- ja DNA-polymeraasiaktiivisuuksia, jotka on saatu suunnatun ja keinotekoisen evoluution avulla.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasin puoliintumisaika 95°C:ssa on yli 40 minuuttia.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi mahdollistaa korkean lämpötilan käänteistranskription suoraan RNA-templaatista, ja käänteistranskriptiovaihe voidaan toistaa useita kertoja lisäämään cDNA-templaatteja.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi mahdollistaa "nollavaiheisen" RT-PCR:n (ei isotermisen käänteistranskriptiovaihetta), koska syklisessä PCR-pidennysvaiheessa käänteistranskriptio ja DNA:n monistuminen tapahtuvat samanaikaisesti.Tämä edistää myös käänteistranskriptioreaktiota korkeissa lämpötiloissa, minimoiden siten RNA:n vahvan sekundaarirakenteen sulatuksessa korkeissa lämpötiloissa kohdatut ongelmat.

· Aptameeripohjaisen kuumakäynnistyskaavan ansiosta RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi tuottaa parempia tuloksia, kun pariutumis- ja pidennyslämpötila on yli 57°C.

· Koska entsyymi on lämmönkestävä, on suositeltavaa suunnitella alukkeita ja koettimia, joilla on erittäin korkea sulamispiste (>60°C).

· On suositeltavaa optimoida lämpökäsittely/pidennysvaiheen lämpötila lämpötilagradientin avulla reaktion asetusprosessin aikana.

· Mitä korkeampi lämpötila, sitä korkeampi on PCR:n spesifisyys.Käänteistranskriptiosykli suoritetaan yleensä korkeammassa lämpötilassa kuin PCR-sykli, koska DNA-aluke:RNA-templaatti-hybridisaatiolla on yleensä korkeampi sulamispiste kuin DNA-aluke:cDNA-templaatti-duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi on geneettisesti muokattu ja optimoitu, ja amplikonin koko on 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasin havaitsemisraja saavuttaa 4 kopiota/

Optimoitu reaktiojärjestelmä (korkean sulamispisteen alukkeiden perustaminen) on esitetty kuvassa.RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasiohjattu RT-PCR osoittaa paremman herkkyyden kuin TaqPathin 1-vaiheinen RT-qPCR master -seos ja alhaisemman havaitsemisen näytteen laimennusgradientin.

Lisää etuja:

Pikakäynnistystoiminto → Ensimmäinen lämpödenaturointivaihe voidaan ohittaa.

Hot-start aptameerikaava → Tarjoaa 100 % entsyymiaktiivisuuden välittömästi ja estää epäspesifisen monistumisen matalissa lämpötiloissa (<57°C).

Katkaisutoiminto → RNA-uuttovaihe jätetään pois, koska RevTaq RT-PCR DNA-polymeraasi pystyy käsittelemään myös raakareaktionäytteitä.Se voi välittömästi tuhota eukaryoottien, bakteerien ja virusten solukalvot kuumassa RT-PCR-syklissä.

IVD-raaka-ainetaso → korkeat laatustandardit ja erittäin kilpailukykyiset hinnat