一、Lisää reaktiojärjestelmän herkkyyttä:

1. Eristä korkealaatuinen RNA:

Onnistunut cDNA-synteesi tulee korkealaatuisesta RNA:sta.Korkealaatuisen RNA:n tulee olla vähintään täyspitkä eikä siinä saa olla käänteiskopioijaentsyymin estäjiä, kuten EDTA tai SDS.RNA:n laatu määrittää enimmäismäärän sekvenssiinformaatiota, jonka voit kopioida cDNA:ksi.Yleinen RNA-puhdistusmenetelmä on yksivaiheinen menetelmä, jossa käytetään guanidiini-isotiosyanaattia/happofenolia.RNaasin hivenmäärien aiheuttaman kontaminaation estämiseksi RNAasipitoisista näytteistä (kuten haimasta) eristetty RNA on säilytettävä formaldehydissä korkealaatuisen RNA:n säilyttämiseksi, erityisesti pitkäaikaista varastointia varten.Rotan maksasta uutettu RNA hajosi periaatteessa sen jälkeen, kun sitä oli säilytetty vedessä viikon ajan, kun taas rotan pernasta uutettu RNA pysyi stabiilina 3 vuoden vedessä säilytyksen jälkeen.Lisäksi yli 4 kb:n transkriptit ovat herkempiä RNaasijäämien aiheuttamalle hajotukselle kuin pienet transkriptit.Säilytettyjen RNA-näytteiden stabiilisuuden lisäämiseksi RNA voidaan liuottaa deionisoituun formamidiin ja säilyttää -70 °C:ssa.RNA:n säilyttämiseen käytettävän formamidin tulee olla vapaa RNA:ta hajottavasta jätteestä.Haiman RNA:ta voidaan säilyttää formamidissa vähintään vuoden ajan.Kun valmistaudut RNA:n käyttöön, voit käyttää seuraavaa menetelmää RNA:n saostamiseen: lisää NaCl 0,2 M:aan ja 4-kertaiseen tilavuuteen etanolia, aseta huoneenlämpötilaan 3-5 minuutiksi ja sentrifugoi 10 000 x g 5 minuuttia.

2. Käytä RNaseH-inaktiivista (RNaseH-) käänteistä transkriptaasia:

RNaasi-inhibiittoreita lisätään usein käänteistranskriptioreaktioihin lisäämään cDNA-synteesin pituutta ja saantoa.RNaasi-inhibiittoreita tulisi lisätä ensimmäisen juosteen synteesireaktion aikana puskurin ja pelkistimen (kuten DTT:n) läsnä ollessa, koska cDNA-synteesiä edeltävä prosessi denaturoi inhibiittorin ja vapauttaa siten sitoutuneen RNaasin, joka voi hajottaa RNA:ta.Proteiinin RNaasi-inhibiittorit estävät vain RNA:n hajoamisen RNaasi A:n, B:n, C:n vaikutuksesta eivätkä estä RNaasia iholla, joten varo, ettet joudu RNaasi:aa sormistasi näiden estäjien käytöstä huolimatta.

Käänteistranskriptaasi katalysoi RNA:n konversiota cDNA:ksi.Sekä M-MLV:llä että AMV:llä on endogeeninen RNaseH-aktiivisuus oman polymeraasiaktiivisuutensa lisäksi.RNaseH-aktiivisuus ja polymeraasiaktiivisuus kilpailevat keskenään hybridinauhasta, joka muodostuu RNA-templaatin ja DNA-alukkeen tai cDNA-pidennysjuosteen väliin, ja hajottavat RNA-juosteen RNA:DNA-kompleksissa.RNaseH-aktiivisuuden hajottama RNA-templaatti ei voi enää toimia tehokkaana substraattina cDNA-synteesille, mikä vähentää cDNA-synteesin saantoa ja pituutta.Siksi olisi hyödyllistä eliminoida käänteiskopioijaentsyymin RNaseH-aktiivisuus tai vähentää sitä suuresti.

SuperScript Ⅱ -käänteiskopioija, RNaseH-MMLV-käänteiskopioija ja thermoScript-käänteistranskriptaasi, RNaseH-AMV, voivat saada enemmän ja enemmän täyspitkää cDNA:ta kuin MMLV ja AMV.RT-PCR-herkkyyteen vaikuttaa cDNA-synteesin määrä.ThermoScript on paljon herkempi kuin AMV.RT-PCR-tuotteiden kokoa rajoittaa käänteistranskriptaasin kyky syntetisoida cDNA:ta, erityisesti kloonattaessa suurempia cDNA:ita.Verrattuna MMLV:hen SuperScripⅡ lisäsi merkittävästi pitkien RT-PCR-tuotteiden saantoa.RNaseH-käänteistranskriptaasilla on myös lisääntynyt lämpöstabiilisuus, joten reaktio voidaan suorittaa normaalia 37-42 °C korkeammissa lämpötiloissa.Käytä ehdotetuissa synteesiolosuhteissa oligo(dT)-aluketta ja 10 μCi [α-P]dCTP:tä.Ensimmäisen juosteen kokonaissaanto laskettiin käyttämällä TCA-saostusmenetelmää.Täyspitkä cDNA analysoitiin käyttämällä koon mukaan lajiteltuja vyöhykkeitä, jotka leikattiin pois ja laskettiin alkalisella agaroosigeelillä.

3. Nosta inkubointilämpötilaa käänteistranskriptiota varten:

Korkeampi inkubointilämpötila auttaa avaamaan RNA:n sekundaarirakenteen, mikä lisää reaktion saantoa.Useimmille RNA-templaateille RNA:n ja alukkeiden inkubointi 65 °C:ssa ilman puskuria tai suolaa, mitä seuraa nopea jäähdytys jäillä, eliminoi useimmat sekundaariset rakenteet ja mahdollistaa alukkeiden sitoutumisen.Joillakin mallineilla on kuitenkin edelleen toissijaisia ​​rakenteita, jopa lämpödenaturoinnin jälkeen.Näiden vaikeiden templaattien monistaminen voidaan suorittaa käyttämällä ThermoScript-käänteiskopioijaa ja asettamalla käänteistranskriptioreaktio korkeampaan lämpötilaan monistumisen parantamiseksi.Korkeammat inkubointilämpötilat voivat myös lisätä spesifisyyttä, varsinkin kun cDNA-synteesiin käytetään geenispesifisiä alukkeita (GSP) (katso luku 3).Jos käytät GSP:tä, varmista, että alukkeiden Tm on sama kuin odotettu inkubointilämpötila.Älä käytä oligo(dT)- ja random-alukkeita yli 60 °C:ssa.Satunnaiset alukkeet vaativat inkuboinnin 25 °C:ssa 10 minuuttia ennen kuin ne nostavat 60 °C:seen.Sen lisäksi, että käytetään korkeampaa käänteistranskriptiolämpötilaa, spesifisyyttä voidaan myös parantaa siirtämällä RNA/aluke-seos suoraan 65 °C:n denaturaatiolämpötilasta käänteistranskription inkubaatiolämpötilaan ja lisäämällä esilämmitetty 2x-reaktioseos (cDNA hot-start -synteesi).Tämä lähestymistapa auttaa estämään molekyylien välisen emäsparin muodostumisen, joka tapahtuu alemmissa lämpötiloissa.RT-PCR:ssä vaadittavaa usean lämpötilan vaihtoa voidaan yksinkertaistaa käyttämällä lämpösyklilaitetta.

Lämpöstabiili Tth-polymeraasi toimii DNA-polymeraasina Mg2+:n läsnä ollessa ja RNA-polymeraasina Mn2+:n läsnä ollessa.Se voidaan pitää lämpimänä enintään 65 °C:n lämpötilassa.Mn2+:n läsnäolo PCR:n aikana kuitenkin vähentää tarkkuutta, mikä tekee Tth-polymeraasista vähemmän sopivan erittäin tarkkaan monistukseen, kuten cDNA:n kloonaukseen.Lisäksi Tth:llä on alhainen käänteistranskription tehokkuus, mikä vähentää herkkyyttä, ja koska käänteiskopiointi ja PCR voidaan suorittaa yhdellä entsyymillä, kontrollireaktioita ilman käänteiskopiointia ei voida käyttää cDNA-monistustuotteiden vertaamiseen kontaminoivaan genomiseen DNA:han.Monistustuotteet erotettiin.

4. Käänteistranskriptiota edistävät lisäaineet:

Lisäaineita, mukaan lukien glyseroli ja DMSO, lisätään ensimmäisen juosteen synteesireaktioon, mikä voi heikentää nukleiinihapon kaksoisjuosteen stabiilisuutta ja irrottaa RNA:n sekundaarirakenteen.Jopa 20 % glyserolia tai 10 % DMSO:ta voidaan lisätä vaikuttamatta SuperScript II:n tai MMLV:n aktiivisuuteen.AMV voi myös sietää jopa 20 % glyserolia ilman aktiivisuuden menetystä.RT-PCR:n herkkyyden maksimoimiseksi SuperScriptⅡ-käänteistranskriptioreaktiossa voidaan lisätä 10 % glyserolia ja inkuboida 45 °C:ssa.Jos 1/10 käänteistranskriptioreaktiotuotteesta lisätään PCR:ään, niin glyserolin pitoisuus monistusreaktiossa on 0,4 %, mikä ei riitä estämään PCR:ää.

5. RNaseH-hoito:

cDNA-synteesireaktioiden käsittely RNaseH:lla ennen PCR:ää voi lisätä herkkyyttä.Joidenkin templaattien kohdalla uskotaan, että RNA cDNA-synteesireaktiossa estää monistustuotteiden sitoutumisen, jolloin RNaseH-käsittely voi lisätä herkkyyttä.Yleensä RNaseH-hoito on tarpeen, kun monistetaan pidempiä täyspitkiä cDNA-kohdetemplaatteja, kuten vähän kopiota mukulasta skeroosia II.Tässä vaikeassa templaatissa RNaseH-käsittely tehosti SuperScript II:n tai AMV-syntetisoidun cDNA:n tuottamaa signaalia.Useimmissa RT-PCR-reaktioissa RNaseH-käsittely on valinnainen, koska PCR-denaturaatiovaihe 95 °C:ssa yleensä hydrolysoi RNA:n RNA:DNA-kompleksissa.

6. Pienen RNA:n havaitsemismenetelmän parantaminen:

RT-PCR on erityisen haastava, kun saatavilla on vain pieniä määriä RNA:ta.RNA-eristyksen aikana kantaja-aineena lisätty glykogeeni auttaa lisäämään pienten näytteiden saantoa.RNaasi-vapaata glykogeenia voidaan lisätä samanaikaisesti Trizolin lisäämisen kanssa.Glykogeeni on vesiliukoista ja sitä voidaan pitää vesifaasissa RNA:n kanssa myöhemmän saostumisen helpottamiseksi.Näytteille, joissa on alle 50 mg kudosta tai 106 viljeltyä solua, RNaasi-vapaan glykogeenin suositeltu pitoisuus on 250 μg/ml.

Asetyloidun BSA:n lisääminen käänteistranskriptioreaktioon SuperScript II:lla voi lisätä herkkyyttä, ja pienille RNA-määrille SuperScript II:n määrän vähentäminen ja 40 yksikön RNaseOut-nukleaasi-inhibiittoria voi lisätä havaitsemistasoa.Jos glykogeenia käytetään RNA:n eristysprosessissa, on silti suositeltavaa lisätä BSA:ta tai RNaasi-inhibiittoria käytettäessä SuperScript II:ta käänteistranskriptioreaktioon.

二、lisää RT-PCR-spesifisyyttä

1. CND-synteesi:

Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi voidaan aloittaa kolmella eri menetelmällä, joiden suhteellinen spesifisyys vaikuttaa syntetisoidun cDNA:n määrään ja tyyppiin.

Satunnaisalukemenetelmä oli vähiten spesifinen kolmesta menetelmästä.Alukkeet pariutuvat useissa kohdissa läpi transkriptin, jolloin syntyy lyhyitä, osittain pitkiä cDNA:ita.Tätä menetelmää käytetään usein 5'-pään sekvenssien saamiseksi ja cDNA:n saamiseksi RNA-templaateista, joissa on sekundaarirakenteen alueita tai terminaatiokohtia, joita käänteiskopioija ei voi replikoida.Pisimmän cDNA:n saamiseksi kussakin RNA-näytteessä olevien alukkeiden suhde RNA:han on määritettävä empiirisesti.Satunnaisten alukkeiden lähtöpitoisuus vaihteli välillä 50 - 250 ng 20 μl:n reaktiota kohden.Koska kokonais-RNA:sta satunnaisia ​​alukkeita käyttäen syntetisoitu cDNA on ensisijaisesti ribosomaalista RNA:ta, poly(A)+RNA valitaan yleensä templaatiksi.

Oligo(dT)-alukkeet ovat spesifisempiä kuin satunnaiset alukkeet.Se hybridisoituu poly(A)-häntään, joka löytyy useimpien eukaryoottisten mRNA:iden 3'-päästä.Koska poly(A)+-RNA on noin 1 % - 2 % kokonais-RNA:sta, cDNA:n määrä ja monimutkaisuus on paljon pienempi kuin satunnaisilla alukkeilla.Korkean spesifisyytensä vuoksi oligo(dT) ei yleensä vaadi RNA:n ja alukkeiden suhteen optimointia ja poly(A)+-valintaa.On suositeltavaa käyttää 0,5 μg oligo(dT) per 20 μl reaktiojärjestelmää.oligo(dT)12-18 sopii useimpiin RT-PCR:iin.ThermoScript RT-PCR -järjestelmä tarjoaa oligo(dT)20:n, koska sen lämpöstabiilisuus on parempi korkeammissa inkubointilämpötiloissa.

Geenispesifiset alukkeet (GSP) ovat spesifisimpiä alukkeita käänteistranskriptiovaiheessa.GSP on antisense-oligonukleotidi, joka voi spesifisesti hybridisoitua RNA:n kohdesekvenssiin, toisin kuin satunnaiset alukkeet tai oligo(dT), jotka pariutuvat kaikkiin RNA:ihin.Samat säännöt, joita käytettiin PCR-alukkeiden suunnittelussa, pätevät GSP:n suunnitteluun käänteistranskriptioreaktioissa.GSP voi olla sama sekvenssi kuin monistusaluke, joka pariutuu mRNA:n 3'-päähän, tai GSP voidaan suunnitella pariutumaan myötävirtaan käänteisamplifikaatioalukkeesta.Joillekin monistetuille kohteille on suunniteltava useampi kuin yksi antisense-aluke onnistuneeseen RT-PCR:ään, koska kohde-RNA:n sekundäärinen rakenne voi estää alukkeen sitoutumisen.On suositeltavaa käyttää 1 pmol antisense GSP:tä 20 μl:n ensimmäisen juosteen synteesireaktiossa.

2. Nosta inkubointilämpötilaa käänteistranskriptiota varten:

GSP-spesifisyyden täyden hyödyn hyödyntämiseksi tulisi käyttää käänteistranskriptaasia, jolla on korkeampi lämpöstabiilisuus.Lämpöstabiileja käänteistranskriptaaseja voidaan inkuboida korkeammissa lämpötiloissa reaktion ankaruuden lisäämiseksi.Esimerkiksi, jos GSP pariutuu 55 °C:ssa, GSP:n spesifisyyttä ei hyödynnetä täysin, jos AMV:tä tai M-MLV:tä käytetään käänteistranskriptioon alhaisella 37 °C:n ankaruudella.SuperScript II ja ThermoScript voidaan kuitenkin reagoida 50 °C:ssa tai korkeammassa lämpötilassa, mikä eliminoi epäspesifiset tuotteet, jotka syntyvät alhaisemmissa lämpötiloissa.Maksimaalisen spesifisyyden saavuttamiseksi RNA/aluke-seos voidaan siirtää suoraan 65 °C:n denaturaatiolämpötilasta käänteistranskription inkubointilämpötilaan ja lisätä esilämmitettyyn 2x-reaktioseokseen (cDNA-synteesi kuumakäynnistys).Tämä auttaa estämään molekyylien välisen emäspariutumisen matalissa lämpötiloissa.RT-PCR:ssä vaadittavat useat lämpötilan muutokset voidaan yksinkertaistaa käyttämällä lämpösyklilaitetta.

3. Vähentää genomisen DNA:n kontaminaatiota:

Mahdollinen RT-PCR:ssä kohdattava vaikeus on genomisen DNA:n kontaminaatio RNA:ssa.Hyvän RNA:n eristysmenetelmän, kuten Trizol Reagentin, käyttö vähentää RNA-valmistetta saastuttavan genomisen DNA:n määrää.Genomisesta DNA:sta peräisin olevien tuotteiden välttämiseksi RNA:ta voidaan käsitellä monistusluokan DNaasi I:llä kontaminoivan DNA:n poistamiseksi ennen käänteistranskriptiota.DNaasi I -digestio lopetettiin inkuboimalla näytteitä 2,0 mM EDTA:ssa 10 minuuttia 65 °C:ssa.EDTA voi kelatoida magnesiumioneja, mikä estää magnesiumionista riippuvan RNA:n hydrolyysin korkeissa lämpötiloissa.

Monistetun cDNA:n erottamiseksi kontaminoivista genomisen DNA:n monistustuotteista voidaan suunnitella alukkeita, jotka kukin pariutuvat erillisiin eksoniin.cDNA:sta peräisin olevat PCR-tuotteet ovat lyhyempiä kuin saastuneesta genomisesta DNA:sta peräisin olevat PCR-tuotteet.Lisäksi kullekin RNA-templaatille suoritettiin kontrollikoe ilman käänteistranskriptiota sen määrittämiseksi, oliko tietty fragmentti peräisin genomisesta DNA:sta vai cDNA:sta.Ilman käänteistranskriptiota saatu PCR-tuote on peräisin genomista.