Kaikki puhuvat qRT-PCR-kokeen periaatteesta, alukkeiden suunnittelusta, tulosten tulkinnasta jne., mutta mielestäni minun pitäisi kertoa teille qRT-PCR:n kokeellisesta toiminnasta.Se on pieni, mutta kyse on tuloksista.

Ennen kuin teet qRT-PCR:n, meillä on oltava selkeä käsitys omasta RNA:stamme ja toimintatavoistamme.Pyrimme loppujen lopuksi saavuttamaan tuloksia, ei vain harjoittelemaan.Joten ennen qRT-PCR:n tekemistä meidän on määritettävä seuraavat ongelmat (joista osa koskee vain SYBR:ää).

1 Oletko varma, että RNA:si ei ole hajonnut?

NanoDrop 2000 voi havaita vain RNA:n pitoisuuden ja puhtauden, mutta ei voi havaita RNA:n eheyttä.

RNA (RNA Intesity Number) -arvo voi kuvastaa RNA:n eheyttä, jonka Agilent 2100 Bioanalyzer -järjestelmä havaitsee.

Kuva: Kaaviokaavio RIN-arvoista eri RNA-näytteille (eukaryootit)

Laboratorioissa ei kuitenkaan yleensä ole Agilent 2100 Bioanalyzer -laitetta.Tässä tapauksessa voimme havaita formaldehydigeelin kautta, mutta RNA:n kokonaismäärän tarve on korkea, joten nopein tapa on käyttää tavallista geelielektroforeesia.Sen on oltava nukleaasivapaassa ympäristössä, joten elektroforeesisäiliö, soolipullo, geelikiinnike ja kampa on huuhdeltava DEPC-vedellä.Agaroosi on myös nukleaasivapaa (kunhan se on juuri avattu), ja latauspuskuri tulee avata mahdollisimman paljon 1,2 % geelillä.

Huomaa, että geelin on oltava täysin liuennut, muuten se aiheuttaa epähomogeenisia juovia, kuten kuvan näytteessä 9 näkyy.Jos jännite on liian korkea tai käynnissä liian kauan, se tuottaa lämpöä ja aiheuttaa RNA:n hajoamista, joten jännitettä ja aikaa tulee hallita järkevästi.Lisäksi geeliajo voi myös edelleen määrittää, onko näytteessä DNA-jäännöksiä, ja tarkkailla, onko annostelukuopan sisällä suuri määrä vyöhykkeitä.

Kuva.RNA:n geelielektroforeesi havaitseminen

2 Oletko varma cDNA:n pitoisuudesta?

Laboratorion isojen veljien kokemus on, että jokaisella inversiolla saadun 20 ul:n järjestelmän cDNA laimennetaan suoraan 20-kertaiseksi, kun taas tohtorintutkinnon suorittaneet sisaret laimennetaan 10-kertaisesti.Olen yleensä riippuvainen tilanteesta.Koska jokaisen henkilön mainitseman RNA:n laatu on erilainen, myös käänteinen taso on erilainen, eikä kääntötekniikka välttämättä ole vakaa.

Joten joka kerta kun saan käänteisen cDNA:n, laimentan sen ensin noin 3 kertaa ja käytän sitten RT-PCR:n tekemiseen siivousgeeniä, syklien määrä on yleensä 25 sykliä, spesifisen pitoisuuden tunnistamiseksi ja sitten lopullisen laimennustekijän määrittämiseksi.

3 Oletko varma, että pohjamaalisi ovat helppokäyttöisiä?

Se voi ylittää qRT-PCR:n sulamiskäyrän, mutta se maksaa silti rahaa.Laboratoriot, joilla ei ole paljon rahaa, kun he saavat paljon alukkeita, he voivat käyttää tavallista RT-PCR:ää nähdäkseen, onko kyseessä yksi vyöhyke, ja tunnistaa alukkeiden spesifisyyden.Jos laboratoriolla ei ole rahapulaa, kaikkien alukkeiden spesifisyys voidaan tunnistaa kerran sulamiskäyrän kautta.

4 Oletko varma, että koeolosuhteet ovat sopivat?

SYBR tulee suojata voimakkaalta valolta, joten yritä sammuttaa ylävalo, kun lisäät SYBR-reagenssia, ja sinun on käytettävä vain himmeää valoa viimeistelemään se.

Säilytä SYBR 4°C:ssa.Kun käytät, käännä varovasti ylös- ja alaspäin, jotta se sekoittuu hyvin vaahtoamisen välttämiseksi, äläkä pyörtele voimakkaasti.

Jotkut nuoremmat sisaret haluavat piirtää merkkejä PCR-tauluun peläten sekoittavansa näytteet, mikä on väärin.Koska merkit todennäköisesti vaikuttavat fluoresoivien signaalien keräämiseen, suosittelen yleensä junioreita käyttämään kokeellisia muistikirjoja auttamaan muistia alla olevan kuvan mukaisesti.

Kuva.qRT-PCR-näytteen latauskaavio

5 Oletko varma, että teet sen oikein?

Muista käyttää käsineitä, käyttää käsineitä, käyttää käsineitä ja sanoa tärkeät asiat kolme kertaa.

Vähentääkseni SYBR:n valolle altistumista, haluan henkilökohtaisesti lisätä ensin mallin, kuten alla olevassa kuvassa näkyy.Kokemuksen mukaan pienen mallimäärän lisääminen aiheuttaa todennäköisesti otantavirheitä.Siksi pienen template-määrän lisäämisestä aiheutuvan virheen minimoimiseksi tuplaan näytteen yleensä uudelleen ja näytettä lisätessä kaksinkertaistan lisätyn H2O2:n määrän vähentämiseksi.

Kuva.Kaavio qRT-PCR-latauksesta

Määritä sitten qRT-PCR-järjestelmä seuraavasti.

Kuva.qRT-PCR-järjestelmän valmistelukaavio

HUOMAA: Määritysprosessi on suoritettava jäällä.

Liitä läpinäkyvä tiivistekalvo näytteen lisäämisen jälkeen.Älä kosketa läpinäkyvän tiivistekalvon pintaa käsilläsi, vaan toimi vain kalvon molemmilla puolilla olevasta tilasta.Koska sormenjäljet ​​voivat myös vaikuttaa fluoresoivien signaalien keräämiseen.Käytä sitten sentrifugia sentrifugoimaan nopeasti 10 sekuntia alhaisella nopeudella, jotta näyte ei roiku seinälle.

Liittyvät tuotteet:

Cell Direct RT-qPCR -sarja

RT Easy II