COVID-19 on tartuntatauti, jonka aiheuttaa vakava akuutti hengitystieoireyhtymä Coronavirus Type 2. Kun henkilö on saanut tartunnan, yleisimpiä oireita ovat kuume, yskä ja hengenahdistus.

Testaukseen käytetyt näytteet voidaan ottaa nenänielun tai suunielun vanupuikolla.

Mikä on PCR?

Tavallinen koronaviruksen havaitsemismenetelmä on polymeraasiketjureaktio, PCR.Tätä menetelmää käytetään laajalti molekyylibiologiassa.Se voi nopeasti kopioida miljoonia tai miljardeja tiettyjä DNA-fragmentteja.

Uusi koronavirus sisältää erittäin pitkän yksijuosteisen RNA-genomin.Näiden virusten havaitsemiseksi PCR:llä RNA-molekyylit on muutettava komplementaarisiksi DNA-sekvensseiksi käänteiskopioijaentsyymin avulla, ja sitten vasta syntetisoitu DNA voidaan monistaa tavanomaisilla PCR-menetelmillä, jotka tunnetaan yleisesti RT-PCR:nä.

RT-PCR-prosessi

RNA:n uuttaminen

Tämän menetelmän suorittamiseksi virus-RNA tulisi pohjimmiltaan uuttaa.Erilaisia ​​RNA-puhdistuspakkauksia voidaan käyttää kätevään, nopeaan ja tehokkaaseen erottamiseen.

Viruksen RNA:n uuttamiseksi kaupallisella pakkauksella lisää näyte ensin mikrosentrifugiputkeen ja sekoita se sitten lyysipuskurin kanssa.Tämä puskuri on voimakkaasti denaturoitunut ja koostuu yleensä fenolista ja guanidiini-isotiosyanaatista.Lisäksi RNaasi-inhibiittoreita on tavallisesti läsnä lyysipuskurissa, jotta varmistetaan ehjän virus-RNA:n eristäminen.

Lyysauspuskurin lisäämisen jälkeen sekoita sekoitusputkea pulssilla ja inkuboi huoneenlämpötilassa.Sitten virus hajotetaan erittäin denaturoivissa olosuhteissa, jotka lyysipuskuri tarjoaa.

Kun näyte on lyysattu, sentrifugiputkea käytetään puhdistusmenettelyyn.Näyte ladataan sentrifugiputkeen ja sentrifugoidaan sitten.

Tämä menetelmä on kiinteäfaasiuuttomenetelmä, jossa stationäärinen faasi koostuu silikageelimatriisista.

Optimaalisissa suola- ja pH-olosuhteissa RNA-molekyylit sitoutuvat piidioksidikalvoon.

Samalla proteiinit ja muut epäpuhtaudet poistetaan.

Laita sentrifugoinnin jälkeen sentrifugiputki puhtaaseen keräysputkeen, hävitä suodos ja lisää sitten pesupuskuri.

Aseta putki uudelleen sentrifugiin pakottaaksesi pesupuskurin kalvon läpi.Tämä poistaa kaikki jäljellä olevat epäpuhtaudet kalvosta jättäen vain RNA:n sitoutuneena silikageeliin.

Kun näyte on pesty, laita putki puhtaaseen mikrosentrifugiputkeen ja lisää eluointipuskuri.

Sitten se sentrifugoidaan eluointipuskurin pakottamiseksi kalvon läpi.Eluutiopuskuri poistaa viruksen RNA:n spin-pylväästä ja saa puhdistetun RNA:n, joka ei sisällä proteiineja, inhibiittoreita ja muita kontaminantteja.

VAIHE 2

Sekoitettu tiiviste

Viruksen RNA:n uuttamisen jälkeen seuraava vaihe on valmistaa reaktioseos PCR-monistusta varten.Tässä vaiheessa käytetään tiivistettä.Tämä konsentroitu liuos on esisekoitettu konsentroitu liuos, joka koostuu esiseoksesta, käänteiskopioijaentsyymistä, nukleotideista, eteenpäin suunnatusta alukkeesta, käänteisalukkeesta, TaqMan-koettimesta ja DNA-polymeraasista.

Lopuksi tämän reaktioseoksen saattamiseksi päätökseen RNA-templaatti lisätään.Putket sekoitetaan pulssivorteksoimalla ja sitten reaktioseos ladataan PCR-levylle.PCR-levy sisältää tavallisesti 96 kuoppaa ja voi analysoida useita näytteitä samanaikaisesti.

VAIHE 3

PCR-monistus

Aseta seuraavaksi levy PCR-laitteeseen, joka on pohjimmiltaan lämpökiertolaite.

Reaaliaikaista RT-PCR:ää käytetään vuoden 2019 uuden koronaviruksen havaitsemiseen monistamalla kohdesekvenssiä RdrRP-geenissä, E-geenissä ja N-geenissä.Kohdegeenin valinta riippuu alukkeesta ja koetinsekvenssistä.

RT-PCR:n ensimmäinen vaihe on käänteistranskriptio.Syntetisoidaan ensimmäinen komplementaarisen DNA:n juoste, jonka käynnistää PCR-käänteisaluke, joka sitoutuu viruksen RNA-genomin komplementaariseen osaan.Sitten käänteistranskriptaasi lisää DNA-nukleotidit alukkeen 3'-päähän syntetisoimaan viruksen RNA:lle komplementaarista DNA:ta.Tämän vaiheen lämpötila ja kesto riippuvat käytetyistä alukkeista, kohde-RNA:sta ja käänteistranskriptaasista.

Seuraavaksi suoritetaan ensimmäinen denaturaatiovaihe, joka johtaa RNA-DNA-hybridin denaturoitumiseen.Tämä vaihe on välttämätön DNA-polymeraasin aktivoimiseksi.Samaan aikaan käänteistranskriptaasi inaktivoituu.

PCR koostuu sarjasta lämpösyklejä.Jokainen sykli koostuu denaturointi-, lämpökäsittely- ja pidennysvaiheista.

Denaturointivaihe sisältää reaktiokammion kuumentamisen 95 celsiusasteeseen ja sen käyttämisen kaksijuosteisen DNA-templaatin denaturointiin.

Seuraavassa vaiheessa reaktiolämpötila lasketaan 58 celsiusasteeseen, jolloin eteenpäin suuntautuva aluke pariutuu yksijuosteisen DNA-templaattinsa komplementaariseen osaan.Hehkutuslämpötila riippuu suoraan pohjamaalin pituudesta ja koostumuksesta.

Pidennysvaiheessa DNA-polymeraasi syntetisoi uuden DNA-juosteen, joka on komplementaarinen DNA-templaattijuosteen kanssa.Lisäämällä templaatille komplementaarisia vapaita ytimiä 5′-3′-suunnassa reaktioseoksesta.Tämän vaiheen lämpötila riippuu käytetystä DNA-polymeraasista.

Ensimmäisen syklin jälkeen saadaan kaksijuosteinen DNA-kohde.

Siirry sitten toiseen jaksoon.Kaksijuosteinen DNA denaturoidaan kahden yksijuosteisen DNA-molekyylin tuottamiseksi.

Seuraavassa vaiheessa reaktiolämpötilaa alennetaan, alukkeet liitetään kuhunkin yksijuosteiseen DNA-templaattiin ja Taq-man-koetin paritetaan kohde-DNA:n komplementaariseen osaan.

TaqMan-koetin koostuu fluoroforista, joka on kovalenttisesti liitetty oligonukleotidikoettimen 5'-päähän.Kun syklilaitteen valonlähde kiihottaa, fluorofori emittoi fluoresenssia.Lisäksi koetin koostuu sammuttimesta 3′-päässä.Reportterigeenin läheisyys sammuttajaan estää fluoresenssin havaitsemisen.

Pidennysvaiheessa DNA-polymeraasi syntetisoi uuden juosteen.Kun polymeraasi saavuttaa TaqMan-koettimen, sen endogeeninen 5'-nukleaasiaktiivisuus katkaisee koettimen ja erottaa väriaineen sammuttajasta.

Jokaisella PCR-syklillä vapautuu enemmän värimolekyylejä, mikä johtaa fluoresenssin intensiteetin kasvuun, joka on verrannollinen syntetisoitujen amplikonien lukumäärään.

Tämän menetelmän avulla voidaan arvioida näytteessä olevan tietyn sekvenssin lukumäärä.Kaksijuosteisten DNA-fragmenttien määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä.Siksi PCR:llä voidaan analysoida hyvin pieniä näytteitä.

Fluoresoivan signaalin, volframihalogeenilampun, virityssuodattimen, heijastimen, linssin, emissiosuodattimen ja latauskytketyn laitteen mittaamiseen käytetään CCD-kameraa.

VAIHE 4 Tunnista

Fluoresoivan signaalin, volframihalogeenilampun, virityssuodattimen, heijastimen, linssin, emissiosuodattimen ja latauskytketyn laitteen mittaamiseen käytetään CCD-kameraa.

Lampusta tuleva suodatettu valo heijastuu heijastimesta, kulkee lauhdutinlinssin läpi ja kohdistuu jokaisen reiän keskelle.Sitten reiästä säteilevä fluoresenssi heijastuu peilistä, kulkee emissiosuodattimen läpi ja havaitsee sen CCD-kameralla.Jokaisessa PCR-syklissä itsevirittyvä fluoroforivalo voidaan havaita CCD:llä.

Se muuntaa kaapatun valon digitaaliseksi dataksi.Tätä menetelmää kutsutaan reaaliaikaiseksi PCR:ksi, ja se mahdollistaa PCR-reaktion etenemisen reaaliaikaisen seurannan.