PCR on laajimmin käytetty nukleiinihappojen monistustekniikka, ja sitä käytetään laajalti sen herkkyyden ja spesifisyyden vuoksi.PCR vaatii kuitenkin toistuvaa lämpödenaturointia eikä pääse eroon instrumentteihin ja laitteisiin luottamisesta aiheutuvista rajoituksista, mikä rajoittaa sen käyttöä kliinisissä kenttätesteissä.

1990-luvun alusta lähtien monet laboratoriot ovat alkaneet kehittää vakiolämpötilan vahvistustekniikkaa, joka ei vaadi lämpödenaturointia.Nyt he ovat kehittäneet silmukkavälitteisen isotermisen amplifikaatioteknologian, juosteen korvaavan isotermisen amplifikaatioteknologian, pyörivän ympyrän isotermisen monistusteknologian ja nukleiinihapposekvenssiriippuvuuden.Isoterminen vahvistustekniikka ja muut tekniikat. 

Loop-välitteinen isoterminen vahvistus

Monistuksen periaate perustuu siihen, että DNA on dynaamisessa tasapainotilassa noin 65 °C:ssa.Kun mikä tahansa aluke on emäsparinen ja pidennetty kaksijuosteisen DNA:n komplementaariseen osaan, toinen juoste dissosioituu ja tulee yksijuosteiseksi.

Tässä lämpötilassa DNA käyttää 4 spesifistä aluketta luottaakseen juosteen syrjäytys-DNA-polymeraasiin saadakseen juosteen syrjäytys-DNA:n synteesin kiertämään itseään jatkuvasti.

Määritä ensin kohdegeenin 6 spesifistä aluetta F3, F2, F1, B1, B2, B3 ja suunnittele sitten 4 aluketta näiden kuuden spesifisen alueen perusteella (kuten alla olevasta kuvasta näkyy):

Forward inner primer (FIP) koostuu F1c:stä ja F2:sta.

Taaksepäin oleva sisäaluke (BIP) koostuu B1c:stä ja B2:sta, ja TTTT:tä käytetään välikkeenä keskellä.

Ulommat alukkeet F3 ja B3 koostuvat vastaavasti kohdegeenin F3- ja B3-alueista.

LAMP-reaktiojärjestelmässä sisemmän alukkeen pitoisuus on useita kertoja ulomman alukkeen pitoisuus.Sisäaluke yhdistetään ensin templaattijuosteen kanssa komplementaarisen juosteen syntetisoimiseksi DNA-kaksoisjuosteen muodostamiseksi.Tämän jälkeen ulompi aluke yhdistetään templaattijuosteen kanssa DNA-kaksoisjuosteen muodostamiseksi.BstDNA-polymeraasin vaikutuksesta sisäisen alukkeen syntetisoima komplementaarinen juoste vapautuu.Useiden reaktioiden jälkeen komplementaarinen juoste muodostaa lopulta yhden DNA-juosteen, jolla on käsipainorakenne.

Käsipainorakenteen DNA:n yksijuosteista itseään käytetään templaattina muodostamaan jatkuvasti siirtymävaiheen kantasilmukkarakenne-DNA:ta, jolla on avoin pää.Sisä- ja ulkoalukkeet ohjaavat siirtymävaiheen kantasilmukkarakenteen DNA:ta käymään jatkuvasti läpi juosteen siirtymä- ja pidennysreaktioita ja muodostavat lopuksi useita eripituisia kantasilmukkarakenteita.DNA-seos.

Silmukkavälitteisen isotermisen vahvistuksen edut ja haitat

LAMPIN edut:

(1) Korkea amplifikaatiotehokkuus, joka voi tehokkaasti monistaa 1-10 kopiota kohdegeenistä 1 tunnissa, ja monistusteho on 10-100-kertainen tavalliseen PCR:ään verrattuna.

(2) Reaktioaika on lyhyt, spesifisyys on vahva, eikä erityisiä laitteita tarvita.

LAMPIN puutteet:

(1) Pohjusteita koskevat vaatimukset ovat erityisen korkeat.

(2) Monistettua tuotetta ei voida käyttää kloonaamiseen ja sekvensointiin, vaan sitä voidaan käyttää vain arviointiin.

(3) Vahvan herkkyytensä ansiosta siitä on helppo muodostaa aerosoleja, mikä aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia ja vaikuttaa testituloksiin.

Ssäikeen siirtymän vahvistus

Strand displacement amplification (SDA) on in vitro isoterminen DNA:n monistustekniikka, joka perustuu entsymaattiseen reaktioon, jonka amerikkalainen tutkija Walker ehdotti ensimmäisen kerran vuonna 1992.

SDA:n perusjärjestelmä sisältää restriktioendonukleaasin, DNA-polymeraasin, jolla on juosteen syrjäytysaktiivisuus, kaksi paria alukkeita, dNTP:itä sekä kalsium- ja magnesiumioneja ja puskurijärjestelmiä.

Juosteen syrjäytysamplifikaation periaate perustuu kemiallisesti modifioituun restriktioendonukleaasin tunnistussekvenssiin kohde-DNA:n molemmissa päissä.Endonukleaasi avaa aukon DNA-juosteessa sen tunnistuskohdassa, ja DNA-polymeraasi laajentaa aukkoa 3′-päästä ja korvaa seuraavan DNA-juosteen.

Korvatut yksittäiset DNA-juosteet voidaan yhdistää alukkeiden kanssa ja pidentää kaksoisjuosteiksi DNA-polymeraasin avulla.Tämä prosessi toistetaan jatkuvasti, jotta kohdesekvenssi vahvistetaan tehokkaasti.

Säikeen siirtymän vahvistustekniikan edut ja haitat

SDA:n edut:

Monistuksen tehokkuus on korkea, reaktioaika on lyhyt, spesifisyys on vahva, eikä erityisiä laitteita tarvita.

SDA:n puutteet:

Tuotteet eivät ole yhtenäisiä, ja jotkin yksisäikeiset ja kaksisäikeiset tuotteet valmistetaan aina SDA-syklissä, ja jätteitä syntyy väistämättä, kun ne havaitaan elektroforeesilla.

Rolling ympyrän vahvistus

Rolling circle amplifikaatiota (RCA) ehdotetaan hyödyntämällä menetelmää DNA:n kopioimiseksi patogeenisistä organismeista pyörivällä ympyrällä.Se viittaa yksijuosteisen pyöreän DNA:n käyttöön templaattina vakiolämpötilassa ja erityiseen DNA-polymeraasiin (kuten Phi29) ) Kiertävän ympyrän DNA-synteesin vaikutuksesta kohdegeenin monistumisen saavuttamiseksi.

RCA voidaan jakaa lineaariseen vahvistukseen ja eksponentiaaliseen vahvistukseen.Lineaarisen RCA:n tehokkuus voi olla 10⁵kertaa, ja eksponentiaalisen RCA:n tehokkuus voi olla jopa 10⁹ajat.

Yksinkertainen ero, kuten alla olevasta kuvasta näkyy, lineaarinen monistus a käyttää vain 1 aluketta, eksponentiaalinen monistus b on 2 aluketta.

Lineaarista RCA:ta kutsutaan myös yhden alukkeen RCA:ksi.Aluke sitoutuu pyöreään DNA:han ja jatkuu DNA-polymeraasin vaikutuksesta.Tuote on lineaarinen yksijuoste, jossa on suuri määrä toistuvia sekvenssejä, jotka ovat tuhansia kertoja yhden silmukan pituisia.

Koska lineaarisen RCA:n tulo on aina kytketty aloitusalukkeeseen, signaalin helppo kiinnitys on suuri etu.

Eksponentiaalinen RCA, joka tunnetaan myös nimellä Hyper haarautunut amplifikaatio HRCA (Hyper haarautunut RCA), eksponentiaalisessa RCA:ssa yksi aluke monistaa RCA-tuotteen, toinen aluke hybridisoituu RCA-tuotteen kanssa ja laajenee, ja korvaus on jo sidottu RCA-tuotteeseen. Alavirran alukkeet laajentavat juostetta ja toistavat laajennus- ja korvaamistuotteen RCA-vahvistimen.

Pyörivän ympyrän nukleiinihappomonistuksen edut ja haitat

RCA:n edut:

Korkea herkkyys, hyvä spesifisyys ja helppokäyttöisyys.

RCA:n puutteet:

Taustaongelmat signaalin tunnistuksen aikana.RCA-reaktion aikana kiertämätön riippulukkokoetin ja sitoutumattoman koettimen templaatti-DNA tai RNA voivat tuottaa joitain taustasignaaleja. 

Nukleiinihapposekvenssiin perustuva monistus

Nukleiinihapposekvenssiin perustuva amplifikaatio (NASBA) on uusi teknologia, joka on kehitetty PCR:n perusteella.Se on jatkuva ja isoterminen nukleiinihapon monistus, jota ohjaa alukepari, jossa on T7-promoottorisekvenssi.Tekniikka voi monistaa templaatti-RNA:n noin 109-kertaisesti noin 2 tunnissa, mikä on 1000 kertaa enemmän kuin perinteinen PCR-menetelmä, eikä vaadi erityisiä laitteita.

Tätä tekniikkaa on käytetty sairauksien nopeaan diagnosointiin heti, kun se ilmestyi, ja monet yritykset käyttävät tätä menetelmää tällä hetkellä RNA-tunnistussarjoissa.

Vaikka RNA-monistuksessa voidaan käyttää myös käänteistranskriptio-PCR-tekniikkaa, NASBA:lla on omat etunsa: se voidaan suorittaa suhteellisen tasaisissa lämpötilaolosuhteissa, ja se on vakaampi ja tarkempi kuin perinteinen PCR-tekniikka.

Reaktio on 41 celsiusastetta ja vaatii AMV:n (avian myeloblastosis virus) käänteiskopioijaentsyymin, RNaasi H:n, T7 RNA-polymeraasin ja parin alukkeita suorittaakseen loppuun.

Prosessi sisältää pääasiassa:

Forward-aluke sisältää T7-promoottorin komplementaarisen sekvenssin.Reaktion aikana eteenpäin suuntautuva aluke sitoutuu RNA-juosteeseen ja AMV-entsyymi katalysoi sitä muodostaen DNA-RNA-kaksoisjuosteen.

RNaasi H pilkkoo hybridi-kaksoisjuosteisen RNA:n ja säilyttää yksijuosteisen DNA:n.

Käänteisalukkeen ja AMV-entsyymin vaikutuksesta muodostuu DNA:n kaksoisjuoste, joka sisältää T7-promoottorisekvenssin.

T7-RNA-polymeraasin vaikutuksesta transkriptioprosessi on valmis ja tuotetaan suuri määrä kohde-RNA:ta.

NASBA:n edut:

(1) Sen alukkeessa on T7-promoottorisekvenssi, mutta vieraalla kaksijuosteisella DNA:lla ei ole T7-promoottorisekvenssiä eikä sitä voida monistaa, joten tällä tekniikalla on korkea spesifisyys ja herkkyys.

(2) NASBA sisällyttää käänteistranskriptioprosessin suoraan monistusreaktioon, mikä lyhentää reaktioaikaa.

NASBA:n haitat:

(1) Reaktiokomponentit ovat monimutkaisempia.

(2) Reaktiokustannusten lisäämiseksi tarvitaan kolmenlaisia ​​entsyymejä.