Viimeisen kymmenen vuoden aikana CRISPR:ään perustuva geeninmuokkausteknologia on kehittynyt nopeasti ja sitä on menestyksekkäästi sovellettu geneettisten sairauksien ja syövän hoidossa ihmisten kliinisissä tutkimuksissa.Samanaikaisesti tutkijat ympäri maailmaa hyödyntävät jatkuvasti uusia työkaluja, joilla on geenien muokkauspotentiaalia olemassa olevien geeninmuokkaustyökalujen ja -ratkaisujen ongelmien ratkaisemiseksi.

Syyskuussa 2021 Zhang Fengin ryhmä julkaisi artikkelin Science-lehdessä [1] ja havaitsi, että laaja valikoima transpostoreita koodasivat RNA-ohjattuja nukleiinihappoentsyymejä ja nimesivät sen Omega-järjestelmäksi (mukaan lukien ISCB, ISRB, TNP8).Tutkimuksessa havaittiin myös, että Omega-järjestelmä käyttää osaa RNA:sta ohjaamaan leikkaavaa DNA:n kaksoisketjua, nimittäin ωRNA:ta.Vielä tärkeämpää on, että nämä nukleiinihappoentsyymit ovat hyvin pieniä, vain noin 30 % CAS9:stä, mikä tarkoittaa, että ne saattavat todennäköisemmin kulkeutua soluihin.

Zhang Fengin tiimi julkaisi 12. lokakuuta 2022 Nature-lehdessä otsikolla: Structure of the Omega Nickase ISRB in Complex with ωrna and Target DNA [2].

Tutkimuksessa analysoitiin edelleen ISRB-ωRNA:n ja kohde-DNA-kompleksin jäädytettyä elektronimikroskoopin rakennetta Omega-järjestelmässä.

ISCB on CAS9:n esi-isä, ja ISRB on sama kohde ISCB:n HNH-nukleiinihappodomeenin puutteelle, joten koko on pienempi, vain noin 350 aminohappoa.DNA tarjoaa myös pohjan jatkokehitykselle ja tekniselle transformaatiolle.

RNA-ohjattu IsrB on transposonien IS200/IS605-superperheen koodaama OMEGA-perheen jäsen.Fylogeneettisen analyysin ja jaettujen ainutlaatuisten domeenien perusteella IsrB on todennäköisesti IscB:n edeltäjä, joka on Cas9: n esi-isä.

Toukokuussa 2022 Cornellin yliopiston Lovely Dragon Laboratory julkaisi artikkelin Science-lehdessä [3], jossa analysoitiin IscB-ωRNA:n rakennetta ja sen DNA:n katkaisumekanismia.

IscB:hen ja Cas9:ään verrattuna IsrB:ltä puuttuu HNH-nukleaasidomeeni, REC-lohko ja suurin osa PAM-sekvenssin kanssa vuorovaikutteisista domeeneista, joten IsrB on paljon pienempi kuin Cas9 (vain noin 350 aminohappoa).IsrB:n pientä kokoa tasapainottaa kuitenkin suhteellisen suuri ohjaus-RNA (sen omega-RNA on noin 300 nt pitkä).

Zhang Fengin ryhmä analysoi IsrB:n (DtIsrB) kryoelektronimikroskoopin rakenteen kostean lämmön anaerobisesta Desulfovirgula thermocuniculi -bakteerista ja sen ωRNA- ja kohde-DNA-kompleksista.Rakenneanalyysi osoitti, että IsrB-proteiinin kokonaisrakenteella oli yhteinen runkorakenne Cas9-proteiinin kanssa.

Mutta ero on siinä, että Cas9 käyttää REC-keilaa helpottaakseen kohteen tunnistamista, kun taas IsrB luottaa ωRNA:han, josta osa muodostaa monimutkaisen kolmiulotteisen rakenteen, joka toimii kuten REC.

Ymmärtääkseen paremmin IsrB:n ja Cas9:n rakenteellisia muutoksia RuvC:n evoluution aikana Zhang Fengin tiimi vertasi Thermus thermophiluksen RuvC:n (TtRuvC), IsrB:n, CjCas9:n ja SpCas9:n DNA:han sitoutuvia rakenteita.

IsrB:n ja sen ωRNA:n rakenneanalyysi selventää, kuinka IsrB-ωRNA yhdessä tunnistaa ja katkaisee kohde-DNA:n, ja tarjoaa myös perustan tämän miniatyrisoidun nukleaasin jatkokehittämiselle ja muokkaukselle.Vertailut muihin RNA-ohjattuihin järjestelmiin tuovat esiin funktionaalisia vuorovaikutuksia proteiinien ja RNA:iden välillä, mikä edistää ymmärrystämme näiden erilaisten järjestelmien biologiasta ja evoluutiosta.

Linkit:

1.https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856

2.https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7220

3.https://www.nature.com/articles/s41586-022-05324-6