Kuulon heikkeneminen (HL) on yleisin aistivamma sairaus ihmisillä.Kehittyneissä maissa noin 80 % lasten kielen kuuroutta koskevista tapauksista johtuu geneettisistä tekijöistä.Yleisimmät ovat yhden geenin viat (kuten kuvassa 1), 124 geenimutaation on havaittu liittyvän ei-syndromiseen kuulonalenemaan ihmisillä, loput ovat ympäristötekijöiden aiheuttamia.Sisäkorvaistute (sisäkorvaan sijoitettu elektroninen laite, joka stimuloi sähköisesti suoraan kuulohermoon) on ylivoimaisesti tehokkain vaihtoehto vaikean HL:n hoitoon, kun taas kuulolaite (ulkoinen elektroninen laite, joka muuntaa ja vahvistaa ääniaaltoja) voi auttaa potilaita, joilla on kohtalainen HL.Tällä hetkellä ei kuitenkaan ole saatavilla lääkkeitä perinnöllisen HL:n (GHL) hoitoon.Viime vuosina geeniterapia on saanut yhä enemmän huomiota lupaavana lähestymistapana sisäkorvan toimintahäiriöiden hoitoon.

Kuva 1.Kuurouteen liittyvän variaatiotyypin jakauma.[1]

Äskettäin Salk Instituten ja Sheffieldin yliopiston tutkijat julkaisivat tutkimustuloksen Molecular Therapy – Methods & Clinical Development -julkaisussa [2], joka osoitti laajan sovellusmahdollisuuden perinnöllisen kuurouden in vivo -geeniterapiassa.Uri Manor, Salk Instituten apulaistutkijaprofessori ja Waitt Center for Advanced Biophotonics -keskuksen johtaja, kertoi syntyneensä vakavalla kuulonalenemalla ja katsoi, että kuulon palauttaminen olisi upea lahja.Hänen aikaisemmassa tutkimuksessaan havaittiin, että Eps8 on aktiinia säätelevä proteiini, jolla on aktiinia sitovia ja sulkevia vaikutuksia;sisäkorvasoluissa Eps8:n muodostama proteiinikompleksi MYO15A:n, WHIRLIN:n, GPSM2:n ja GNAI3:n kanssa esiintyy pääasiassa eniten Hiuskimppujen ylläpitoon tarvitaan pitkien stereosilmien kärjet, jotka yhdessä MYO15A:n kanssa lokalisoivat BAIAP2L2:n lyhyempien stereosilmien kärkiin.Siksi Eps8 voi säädellä karvasolujen stereosilmien pituutta, mikä on välttämätöntä normaalille kuulotoiminnalle;Eps8-deleetio tai -mutaatio johtaa lyhyisiin stereosiloihin, jotka tekevät siitä kyvyttömän muuttamaan ääntä oikein sähköisiksi signaaleiksi aivojen havaitsemiseksi, mikä puolestaan ​​​​johtaa kuurouteen..Samaan aikaan Sheffieldin yliopiston professori Walter Marcotti havaitsi, että karvasolut eivät voi kehittyä normaalisti ilman Eps8:aa.Tässä tutkimuksessa Manor ja Marcotti tekivät yhteistyötä tutkiakseen, voisiko Eps8:n lisääminen stereociliaarisiin soluihin palauttaa niiden toiminnan ja vuorostaan ​​parantaa kuuloa hiirillä.Tutkimusryhmä käytti adeno-associated virus (AAV) -vektoria Anc80L65 kuljettamaan villityypin EPS8:n sisältävän koodaavan sekvenssin Eps8-/- vastasyntyneiden P1-P2-hiirten simpukkaan pyöreän ikkunan kalvoinjektiolla;hiiren sisäkorvasoluissa Stereokiloiden toiminta korjattiin ennen niiden kypsymistä;ja korjausvaikutusta karakterisoi kuvantamistekniikka ja stereocilian mittaus.Tulokset osoittivat, että Eps8 pidensi stereosilmien pituutta ja palautti hiussolujen toiminnan matalataajuisissa soluissa.He havaitsivat myös, että ajan myötä solut näyttivät menettäneen kykynsä pelastua tällä geeniterapialla.Seurauksena on, että tämä hoito on ehkä annettava kohdussa, koska Eps8-/- karvasolut ovat saattaneet kypsyä tai kerääntyä korjaamattomia vaurioita hiirten syntymän jälkeen."Eps8 on proteiini, jolla on monia erilaisia ​​toimintoja, ja siellä on vielä paljon tutkittavaa", Manor sanoi.Tulevaisuudessa selvitetään Eps8-geeniterapian vaikutusta kuulon palauttamiseen eri kehitysvaiheissa ja onko mahdollista pidentää hoitomahdollisuuksia.Sattumalta marraskuussa 2020 Israelin Tel Avivin yliopiston professori KarenB Avraham julkaisi tulokset EMBO Molecular Medicine -lehdessä [3], jossa hän käytti innovatiivista geeniterapiatekniikkaa vaarattoman synteettisen adeno-assosioituneen viruksen AAV9-PHP luomiseksi.B, Syne4-/- hiirten karvasolujen geenivika korjattiin injektoimalla Syne4:n koodaavan sekvenssin sisältävä virus hiiren sisäkorvaan, jolloin se pääsi hiirten karvasoluihin ja vapauttaa kuljetetun geneettisen materiaalin, jolloin ne kypsyivät ja toimivat normaalisti (kuten kuvassa 2).

Kuva 2.Kaaviomainen esitys sisäkorvan anatomiasta, jossa keskitytään Cortin elimeen ja nesprin-4:n solutoimintoihin.

Voidaan nähdä, että geeniterapian käytöllä perinnöllisten sairauksien geenitason hoitamisen tarkoituksen saavuttamiseksi insertoimalla, poistamalla tai korjaamalla mahdollisia mutatoituneita geenejä hoitoa varten (eli säätämällä taudin geneettisiä muutoksia) on korkea kliininen vaikutus.sovellusnäkymät.Nykyiset geeniterapiamenetelmät geneettisesti puutteelliseen kuurouteen voidaan jakaa seuraaviin luokkiin:

geenin korvaaminen

Geenin korvaaminen on luultavasti "yksinkertaisin" geeniterapian muoto, joka perustuu viallisen geenin tunnistamiseen ja korvaamiseen geenin normaalilla tai villityypin kopiolla.Ensimmäinen onnistunut sisäkorvan geeniterapiatutkimus vesikulaarisen glutamaattikuljettaja 3:n (VGLUT3) geenin deleetiosta johtuvaan kuulon heikkenemiseen;AAV1-välitteinen eksogeenisen VGLUT3:n yli-ilmentyminen sisäkorvan karvasoluissa (IHC) voi johtaa jatkuvaan kuulon palautumiseen, osittaiseen nauhasynaptisen morfologian palautumiseen ja kouristukseen [4].Esimerkeissä, jotka sisältävät edellä johdannossa kuvatut kaksi AAV:n toimittamaa geenikorvausta, on kuitenkin tärkeää huomata, että tietyntyyppisissä geenideleetioperinnöllisissä kuulonalenemissa käytetyt hiirimallit ovat ajallisesti erilaisia ​​kuin ihmisillä, ja P1-hiirillä sisäkorva on kypsässä kehitysvaiheessa.Sitä vastoin ihmisillä on syntyessään kypsä sisäkorva.Tämä ero estää hiiren tulosten mahdollisen soveltamisen ihmisen perinnöllisten kuuroushäiriöiden hoitoon, ellei geeniterapiaa toimiteta kypsiin hiiren korviin.

Geenimuokkaus: CRISPR/Cas9

"Geenikorvaukseen" verrattuna geenien muokkaustekniikan kehitys on tuonut kynnyksellä geneettisten sairauksien hoidon juurelta.Tärkeää on, että geenimuokkausmenetelmä korvaa perinteisten yli-ilmentämisgeeniterapiamenetelmien puutteet, jotka eivät sovellu vallitseviin perinnöllisiin kuuroussairauksiin, sekä ongelman, että yli-ilmentymismenetelmä ei kestä kauan.Sen jälkeen kun kiinalaiset tutkijat tyrmäsivät Myo6C442Y-mutanttialleelin Myo6WT/C442Y-hiiristä käyttämällä AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2-geenin muokkausjärjestelmää, ja 5 kuukauden sisällä poistosta, hiiret. Mallin kuulotoiminto palautettiin;samaan aikaan havaittiin myös, että sisäkorvan karvasolujen eloonjäämisaste parani, värien muoto muuttui säännölliseksi ja sähköfysiologiset indikaattorit korjautuivat [5].Kyseessä on ensimmäinen tutkimus maailmassa, jossa on käytetty CRISPR/Cas9-teknologiaa Myo6-geenimutaation aiheuttaman perinnöllisen kuurouden hoitoon, ja se on tärkeä tutkimustulos geenieditointitekniikasta perinnöllisen kuurouden hoitoon.Hoidon kliininen käännös tarjoaa vankan tieteellisen perustan.

Geeniterapian toimitusmenetelmät

Jotta geeniterapia onnistuisi, paljaat DNA-molekyylit eivät hydrofiilisyytensä ja fosfaattiryhmien negatiivisen varauksen vuoksi pääse tehokkaasti tunkeutumaan soluihin, ja täydennettyjen nukleiinihappomolekyylien eheyden varmistamiseksi on valittava turvallinen ja tehokas menetelmä.Täydennetty DNA toimitetaan kohdesoluun tai -kudokseen.AAV:ta käytetään laajalti kuljetusvälineenä sairauden hoidossa sen korkean tarttuvan vaikutuksen, alhaisen immunogeenisyyden ja laajan tropismin vuoksi eri kudostyypeille.Tällä hetkellä laaja tutkimustyö on määrittänyt AAV:n eri alatyyppien tropismin suhteessa eri solutyyppeihin hiiren simpukoissa.Käyttämällä AAV-kuljetusominaisuuksia yhdessä soluspesifisten promoottoreiden kanssa voidaan saavuttaa soluspesifinen ilmentyminen, mikä voi vähentää kohteen ulkopuolisia vaikutuksia.Lisäksi vaihtoehtona perinteisille AAV-vektoreille kehitetään jatkuvasti uusia synteettisiä AAV-vektoreita, joilla on ylivoimainen transduktiokyky sisäkorvassa, joista AAV2/Anc80L65 on laajimmin käytetty.Ei-viraaliset antomenetelmät voidaan jakaa edelleen fysikaalisiin menetelmiin (mikroinjektio ja elektroporaatio) ja kemiallisiin menetelmiin (lipidipohjaiset, polymeeripohjaiset ja kultananohiukkaset).Molempia lähestymistapoja on käytetty perinnöllisten kuuroushäiriöiden hoidossa, ja ne ovat osoittaneet erilaisia ​​etuja ja rajoituksia.Vehikkelinä geeniterapiaan käytettävän kuljetusvehikkelin lisäksi voidaan käyttää erilaisia ​​lähestymistapoja in vivo -geenin antamiseen eri kohdesolutyyppien, antoreittien ja terapeuttisen tehokkuuden perusteella.Sisäkorvan monimutkainen rakenne vaikeuttaa kohdesolujen saavuttamista ja genomieditointiaineiden jakautuminen on hidasta.Kalvomainen labyrintti sijaitsee ohimoluun luisessa labyrintissa ja sisältää sisäkorvakanavan, puoliympyrän muotoisen kanavan, utricle- ja ilmapallon.Sen suhteellinen eristäminen, minimaalinen lymfaattinen kierto ja verestä erottaminen verilabyrinttiesteen avulla rajoittavat terapeuttisten aineiden tehokasta systeemistä toimittamista vain vastasyntyneille hiirille.Geeniterapiaan soveltuvien virustiitterien saamiseksi tarvitaan virusvektorien suora paikallinen injektio sisäkorvaan.Vakiintuneita injektioreittejä ovat [6]: (1) pyöreä ikkunakalvo (RWM), (2) trakeostomia, (3) endolymfaattinen tai perilymfaattinen sisäkorvakehä, (4) pyöreä ikkunakalvo sekä putken uloke (CF) (kuten kuvassa 3).

Kuva 3.Geeniterapian sisäkorvaannostus.

Vaikka geeniterapiassa on tehty monia edistysaskeleita kliinisten translaatiotavoitteiden perusteella, työtä on tehtävä enemmän ennen kuin geeniterapiasta voi tulla ensisijainen hoitovaihtoehto geneettisiä sairauksia sairastaville potilaille, erityisesti turvallisten ja tehokkaiden vektoreiden ja antomenetelmien kehittämisessä.Uskomme kuitenkin, että lähitulevaisuudessa tämäntyyppisistä hoidoista tulee yksilöllisen terapian peruskappale, ja niillä on erittäin myönteinen vaikutus geneettisistä sairauksista kärsivien ihmisten ja heidän perheidensä elämään.

Foregene on myös tuonut markkinoille korkean suorituskyvyn kohdegeenien seulontasarjan, joka on nopea ja pystyy suorittamaan käänteiskopiointia ja qPCR-reaktioita ilman RNA:n uuttamista.

Tuotelinkit

Cell Direct RT-qPCR -sarja – Taqman/SYBR GREEN I

Jos haluat lisätietoja tuotteista, ota yhteyttä:

overseas@foregene.com