Molekyylidiagnostiikkateknologiassa molekyylibiologian menetelmillä havaitaan ihmiskehon ja erilaisten patogeenien geneettisen materiaalin ilmentymistä ja rakennetta, jotta saavutetaan sairauksien ennustamisen ja diagnosoinnin tarkoitus.

Viime vuosina molekyylidiagnostiikan uudistumisen ja iteroinnin myötä molekyylidiagnostiikan kliininen sovellus on laajentunut ja syventynyt, ja molekyylidiagnostiikan markkinat ovat siirtyneet nopean kehityksen aikakauteen.

Kirjoittaja tekee yhteenvedon markkinoilla olevista yleisimmistä molekyylidiagnostiikan tekniikoista ja jakautuu kolmeen osaan: ensimmäinen osa esittelee PCR-teknologiaa, toinen osa nukleiinihappojen isoterminen monistustekniikka ja toinen osa sekvensointitekniikkaa.

01

Osa I: PCR-tekniikka

PCR-tekniikka

PCR (polymeraasiketjureaktio) on yksi in vitro DNA:n monistustekniikoista, jolla on yli 30 vuoden historia.

Kary Mullis Cetuksesta, USA:sta, aloitti PCR-tekniikan vuonna 1983.Mullis haki PCR-patenttia vuonna 1985 ja julkaisi ensimmäisen PCR-akateemisen tutkimuksen samana vuonna.Mullis voitti Nobelin kemian palkinnon vuonna 1993.

PCR:n perusperiaatteet

PCR voi monistaa kohde-DNA-fragmentteja yli miljoona kertaa.Periaate on, että DNA-polymeraasin katalyysin aikana templaattina käytetään lähtöjuoste-DNA:ta ja pidentämisen lähtökohtana käytetään spesifistä aluketta.Se replikoituu in vitro sellaisilla vaiheilla kuin denaturaatio, pariutuminen ja pidentäminen.Tytärjuosteen DNA:n prosessi, joka on komplementaarinen emäjuosteen templaatti-DNA:lle.

Tavallinen PCR-prosessi on jaettu kolmeen vaiheeseen:

1. Denaturointi: Käytä korkeaa lämpötilaa DNA:n kaksoisjuosteiden erottamiseen.DNA:n kaksoisjuosteiden väliset vetysidokset katkeavat korkeissa lämpötiloissa (93-98 °C).

2. Hehkutus: Kun kaksijuosteinen DNA on erotettu, lämpötilaa alennetaan niin, että aluke voi sitoutua yksijuosteiseen DNA:han.

3. Extension: DNA-polymeraasi alkaa syntetisoida komplementaarisia juosteita pitkin DNA-säikeitä sitoutuneista alukkeista, kun lämpötilaa lasketaan.Kun pidennys on valmis, sykli päättyy ja DNA-fragmenttien määrä kaksinkertaistuu.

Kun näitä kolmea vaihetta edestakaisin 25-35 kertaa, DNA-fragmenttien määrä kasvaa eksponentiaalisesti.

PCR:n nerokkuus on, että eri kohdegeeneille voidaan suunnitella erilaisia ​​alukkeita, jolloin kohdegeenifragmentit voidaan monistaa lyhyessä ajassa.

Toistaiseksi PCR voidaan jakaa kolmeen kategoriaan, nimittäin tavalliseen PCR:ään, fluoresoivaan kvantitatiiviseen PCR:ään ja digitaaliseen PCR:ään.

Tavallisen PCR:n ensimmäinen sukupolvi

Käytä tavallista PCR-amplifikaatioinstrumenttia kohdegeenin monistamiseen ja käytä sitten agaroosigeelielektroforeesia tuotteen havaitsemiseen. Vain kvalitatiivinen analyysi voidaan tehdä.

Ensimmäisen sukupolven PCR:n tärkeimmät haitat:

- Altis epäspesifiselle vahvistukselle ja väärille positiivisille tuloksille.

-Havaitseminen kestää kauan ja toiminta on hankalaa.

- Vain laadullinen testaus voidaan tehdä.

Toisen sukupolven fluoresenssin kvantitatiivinen PCR

Fluoresenssikvantitatiivista PCR:ää (Real-Time PCR), joka tunnetaan myös nimellä qPCR, käytetään monistettujen tuotteiden kerääntymisen seuraamiseen fluoresoivien signaalien kerääntymisen kautta lisäämällä fluoresoivia koettimia, jotka voivat osoittaa reaktiojärjestelmän etenemisen, ja arvioida tuloksia fluoresenssikäyrän avulla, ja se voi olla kvantifioidun arvon ja standardikäyrän avulla.

Koska qPCR-tekniikkaa toteutetaan suljetussa järjestelmässä, kontaminaation todennäköisyys pienenee ja fluoresenssisignaalia voidaan tarkkailla kvantitatiivista havaitsemista varten, joten se on laajimmin käytetty kliinisessä käytännössä ja siitä on tullut hallitseva tekniikka PCR:ssä.

Reaaliaikaisessa fluoresoivassa kvantitatiivisessa PCR:ssä käytetyt fluoresoivat aineet voidaan jakaa: TaqMan-fluoresoivat koettimet, molekyylimajakat ja fluoresoivat väriaineet.

1) TaqMan fluoresoiva anturi:

PCR-monistuksen aikana lisätään spesifinen fluoresoiva koetin samalla kun lisätään alukepari.Koetin on oligonukleotidi, ja kaksi päätä on vastaavasti leimattu reportterifluoresoivalla ryhmällä ja sammuttajafluoresoivalla ryhmällä.

Kun koetin on ehjä, sammutusryhmä absorboi reportteriryhmän lähettämän fluoresoivan signaalin;PCR-monistuksen aikana Taq-entsyymin 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuus katkaisee ja hajottaa koettimen, jolloin reportterifluoresoiva ryhmä ja sammuttaja Fluoresoiva ryhmä erotetaan siten, että fluoresenssin seurantajärjestelmä voi vastaanottaa muodostuneen fluoresenssisignaalin, eli joka kerta kun DNA-juoste fluoresoi, fluoresoi ja fluoresoi DNA-juoste. on täysin synkronoitu PCR-tuotteen muodostumisen kanssa.

2) SYBR-fluoresoivat värit:

PCR-reaktiojärjestelmässä lisätään ylimäärä SYBR-fluoresoivaa väriainetta.Kun SYBR-fluoresoiva väriaine on epäspesifisesti liitetty DNA:n kaksoisjuosteeseen, se lähettää fluoresoivan signaalin.SYBR-väriainemolekyyli, jota ei ole sisällytetty ketjuun, ei lähetä fluoresoivaa signaalia, mikä varmistaa fluoresoivan signaalin. PCR-tuotteiden lisääntyminen on täysin synkronoitu PCR-tuotteiden lisääntymisen kanssa.SYBR sitoutuu vain kaksijuosteiseen DNA:han, joten sulamiskäyrää voidaan käyttää määrittämään, onko PCR-reaktio spesifinen.

3) Molekyylimajakat

Se on varsisilmukka kaksoisleimattu oligonukleotidikoetin, joka muodostaa noin 8 emäksen hiusneularakenteen 5 ja 3 päässä.Molemmissa päissä olevat nukleiinihapposekvenssit ovat komplementaarisesti pariutuneet, mikä saa aikaan fluoresoivan ryhmän ja sammutusryhmän tiukan.Sulje, se ei tuota fluoresenssia.

Kun PCR-tuote on muodostunut, molekyylimajakan keskiosa yhdistetään pariutumisprosessin aikana spesifisen DNA-sekvenssin kanssa ja fluoresoiva geeni erotetaan sammuttajageenistä fluoresenssin tuottamiseksi.

Toisen sukupolven PCR:n tärkeimmät haitat:

Herkkyys puuttuu edelleen, ja vähäisten näytteiden tunnistus ei ole tarkkaa.

Taustalla on vaikutusta, ja tulos on herkkä häiriöille.

Kolmannen sukupolven digitaalinen PCR

Digitaalinen PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) laskee kohdesekvenssin kopiomäärän päätepisteen havaitsemisen avulla ja voi suorittaa tarkan absoluuttisen kvantitatiivisen havaitsemisen ilman sisäisiä kontrolleja ja standardikäyriä.

Digitaalinen PCR käyttää päätepisteiden havaitsemista, eikä se ole riippuvainen Ct-arvosta (syklin kynnysarvo), joten amplifikaatiotehokkuus vaikuttaa vähemmän digitaaliseen PCR-reaktioon ja PCR-reaktion estäjien sietokyky paranee suurella tarkkuudella ja toistettavuudella.

Korkean herkkyyden ja suuren tarkkuuden ominaisuuksien vuoksi PCR-reaktion estäjät eivät helposti häiritse sitä, ja se voi saavuttaa todellisen absoluuttisen kvantifioinnin ilman standardituotteita, joista on tullut tutkimuksen ja sovellusten hotspot.

Reaktioyksikön eri muotojen mukaan se voidaan jakaa kolmeen tyyppiin: mikrofluidi-, siru- ja pisarajärjestelmät.