PCR-reaktion erinomainen ominaisuus on sen suuri amplifikaatiokapasiteetti ja erittäin korkea herkkyys.Parantaaksemme PCR-suorituskykyä ja havaitsemistehokkuutta olemme sitoutuneet parantamaan PCR-amplifikaatiokapasiteettia ja havaitsemisherkkyyttä, mutta päänsärky on koevaiheessa.Vääriä positiivisia tuloksia esiintyy usein, ja hyvin pieni määrä näytteen ristikontaminaatiota tai PCR-tuotteen kontaminaatiota voi aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia kokeessa.
Viisi PCR-tuotteen kontaminaatiotyyppiä
PCR-kontaminaation syitä on monia, jotka voidaan karkeasti jakaa seuraaviin luokkiin:
Näytteen kontaminaatio johtuu pääasiassa näytteen keräysastian kontaminaatiosta, tai kun näyte asetetaan, se vuotaa ulos säiliöstä löysän tiivistyksen vuoksi tai näyte on kiinnittynyt säiliön ulkopuolelle, mikä aiheuttaa ristikontaminaation;Kontaminaatio johtaa kontaminaatioon näytteiden välillä;Jotkut mikrobinäytteet, erityisesti virukset, voivat levitä aerosolien mukana tai muodostaa aerosoleja, mikä johtaa molemminpuoliseen kontaminaatioon.
Pääsyynä on se, että PCR-reagenssien valmistuksen aikana näytepistooli, säiliö, kahdesti tislattu vesi ja muut liuokset kontaminoituvat PCR-nukleiinihappotemplaatilla.
Molekyylibiologian laboratorioissa ja joissakin laboratorioissa, jotka käyttävät kloonattuja plasmideja positiivisina kontrolleina, myös kloonattujen plasmidien kontaminaatioongelma on yleinen.Koska kloonausplasmidin pitoisuus yksikkötilavuudessa on melko korkea ja puhdistusprosessissa tarvitaan lisää työkaluja ja reagensseja, ja elävien solujen plasmidi on erittäin todennäköisesti kontaminoitunut elävien solujen voimakkaan kasvu- ja lisääntymiskyvyn vuoksi.
Monistettujen tuotteiden kontaminaatio on PCR-reaktioiden yleisin kontaminaatio-ongelma.Koska PCR-tuotteen kopiomäärä on suuri (yleensä 1013 kopiota/ml), mikä on paljon suurempi kuin PCR-detektiokopiomäärän raja, hyvin pieni määrä PCR-tuotteen kontaminaatiota voi aiheuttaa vääriä positiivisia tuloksia.
Aerosolisaaste on todennäköisin PCR-tuotteiden saastumismuoto, ja se on myös helpoin jättää huomiotta.Se muodostuu nestepinnan ja ilman välisestä kitkasta.Yleensä aerosolikontaminaatiota voi muodostua, kun kansi avataan, näytettä imetään tai jopa reaktioputkea ravistellaan voimakkaasti.Laskelmien mukaan aerosolihiukkanen voi sisältää 48 000 kopiota, joten sen aiheuttama saastuminen on erityishuomiota vaativa ongelma.
Erityisesti testauslaboratoriot käyttävät usein samaa alukeparia tietyn geenin testaamiseen.Ajan myötä laboratoriotilassa tapahtuu suuri määrä PCR-tuotteen kontaminaatiota.Kun tällainen saastuminen tapahtuu, sitä on vaikea poistaa lyhyessä ajassa.
Kolmelle ensimmäiselle saastetyypille voidaan käyttää tehokkaita keinoja välttää, mutta PCR-tuotteiden aiheuttamaa saastumista on vaikea estää, varsinkin epästandardien PCR-laboratorioiden rakentamisessa.PCR-prosessissa, kun pipetin kärki imee ja puhaltaa nestettä ja PCR-putken kansi avataan, muodostuu aerosoli.Aerosolin kuljettamia DNA-molekyylejä (yksi aerosoli voi kuljettaa kymmeniä tuhansia DNA:ta) on vaikea poistaa, koska ne kelluvat ilmassa.Kun seuraava PCR-koekierros on otettu käyttöön, vääriä positiivisia tulee väistämättä.
Kuten alla olevasta kuvasta näkyy, negatiivinen kontrolli vahvisti myös vastaavaa kiinnostavaa vyöhykettä:
Ensimmäinen osa tästä PCR-saastumista ja ehkäisystä käsittelevästä numerosta esitellään tässä.Seuraava numero tuo sinulle toisen osan "PCR-tuotekontaminaation ehkäisy", joten pysy kuulolla!
Postitusaika: 25.7.2017
