Suora PCR on reaktio, joka käyttää suoraan eläin- tai kasvikudoksia monistukseen ilman nukleiinihappouuttoa.Monin tavoin suora PCR toimii kuten tavallinen PCR

Suurin ero on suorassa PCR:ssä käytettävä räätälöity puskuri, näyte voidaan suoraan altistaa PCR-reaktiolle ilman nukleiinihappouuttoa, mutta entsyymien sietokyvylle ja suorassa PCR-reaktiossa mukana olevan puskurin yhteensopivuudelle on vastaavat vaatimukset.

Vaikka tavallisissa näytteissä on enemmän tai vähemmän PCR-estäjiä, suoralla PCR:llä voidaan silti saavuttaa luotettava monistus entsyymien ja puskurien vaikutuksesta.Perinteinen PCR-reaktio vaatii templaattina korkealaatuista nukleiinihappoa, joka voi estää PCR-reaktion sujuvan etenemisen, jos templaatti sisältää proteiineja ja muita epäpuhtauksia.Suora PCR on tällä hetkellä yksi suosituimmista tekniikoista molekyylidiagnostiikan alalla.

01 Direct PCR:ää käytettiin alun perin eläimille ja kasveille

Varhaisin suoran PCR:n sovellus on eläinten ja kasvien alalla, kuten rotan, kissan, kanan, kanin, lampaan, naudan jne. veressä, kudoksessa ja karvassa, kasvien lehdet ja siemenet jne., joita käytetään genotyypityksen, siirtogeenisten, plasmidien havaitsemisen, geenipoistoanalyysin, DNA-lähteen tunnistamisen, lajin tunnistamisen, SNP-analyysin ja muiden alojen tutkimiseen.

Näillä kentillä on joitain yhteisiä piirteitä, eli kohdegeenipitoisuus on suhteellisen korkea ja nukleiinihappojen uuttaminen hankalaa, joten suora PCR voi säästää aikaa ja vaikuttaa vain vähän tuloksiin, vaan myös säästää kustannuksia.

Patogeenien havaitsemiseen käytetty suora PCR on viime vuosien juttu, jotkut PCR-reagenssien valmistajat ovat panostaneet tähän suuntaan innovaatioita tehdessään.Varsinkin tässä COVID-19-epidemiassa markkinoille on ilmestynyt monia tällaisia ​​havaitsemistuotteita, kuten Foregenen tutkima ja kehittämä SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method), joka käyttää Real-time RT PCR -teknologiaa (rRT-PCR) in human orgeal acids in humanic orgeal acids SARS-2 nucle-CoV-CoV kvalitatiiviseen havaitsemiseen. vanupuikkonäytteitä.

Foregene on yksi niistä yrityksistä, jotka käyttävät suoraa PCR-tekniikkaa normaalien ORF1ab-, N-, E- javariantti nukleiinihapot ihmisen nenänielun tai suunnielun vanupuikkonäytteissä, kuten SARS-CoV-2 B.1.1.7 -linja (UK), B.1.351-linja (ZA), B.1.617-linja (IND) ja P.1-linja (BR).

02  Suoraan PCR:ään tarvittavat reagenssit

Näyte lysaatti

Näytelysaatti voidaan konfiguroida itse tai ostaa.Ero eri merkkien lysaattien koostumuksissa tekee hajoamiskyvystä erilaisen, jolloin hajoamisaika on hieman erilainen.Esimerkiksi eläinkudosnäytteiden valmistukseen suositellaan yleensä 30 minuuttia tai yön yli tapahtuvaa lyysiä, ja virusten lyysiliuos vaihtelee 3-10 minuutin välillä.

PCR-pääsekoitus

On suositeltavaa käyttää hot-start DNA-polymeraasia spesifisen monistumisen tehostamiseksi ja monistuskyvyn lisäämiseksi.Suoran PCR:n ydin on erittäin sietävä polymeraasi.

Eliminoi tai inhiboi näytteen komponentit, jotka vaikuttavat DNA:n monistumiseen

Kun näyte on käsitelty lysaatilla, proteiinit, lipidit ja muut solujätteet vapautuvat, nämä aineet estävät PCR-reaktion.Siksi suora PCR vaatii vastaavien poistoaineiden tai inhibiittoreiden lisäämisen näiden tekijöiden vaikutuksen vähentämiseksi.

03  Kokoelma viisi tietopistettä suorasta PCR:stä

Ensinnäkin Direct PCR -tekniikka on suora PCR-tekniikka erilaisille biologisille näytteille.Tässä teknisessä tilanteessa ei ole tarvetta erottaa ja uuttaa nukleiinihappoa, käyttää suoraan kudosnäytettä kohteena ja lisätä kohdegeenialukkeita PCR-reaktion suorittamiseksi.

Toiseksi Direct PCR -tekniikka ei ole vain perinteinen DNA-templaatin monistustekniikka, vaan se sisältää myös RNA-templaatin käänteistranskriptio-PCR:n.

Kolmanneksi Direct PCR -tekniikka ei ainoastaan ​​suorita suoraan rutiininomaisia ​​kvalitatiivisia PCR-reaktioita kudosnäytteille, vaan sisältää myös reaaliaikaisia ​​qPCR-reaktioita, jotka edellyttävät reaktiojärjestelmältä vahvaa taustafluoresenssihäiriötä estävää kykyä ja endogeenisen fluoresenssin sammuttamista antagonistisen kyvyn.

Neljänneksi Direct PCR -tekniikan kohteena olevat näytteet tarvitsevat vain nukleiinihappotemplaattien vapauttamisen, eivätkä ne poista proteiineja, polysakkarideja, suola-ioneja jne., jotka häiritsevät PCR-reaktiota.Mikä vaatii reaktiojärjestelmän nukleiinihappopolymeraasin ja PCR-sekoituksen erinomaista vastustuskykyä ja sopeutumiskykyä entsyymiaktiivisuuden ja replikaatiotarkkuuden varmistamiseksi monimutkaisissa olosuhteissa.

Viidenneksi Direct PCR -tekniikalla kohdennettu kudosnäyte ilman nukleiinihapporikastuskäsittelyä ja templaatin määrä on hyvin pieni, mikä edellyttää reaktiosysteemiltä erittäin suurta herkkyyttä ja monistustehokkuutta.