Uskon, että jokainen kohtaa aina tällaisia ​​tai sellaisia ​​ongelmia tehdessään PCR-reaktioita, mutta useimmat niistä voidaan luokitella kahteen pääongelmaan:

Liian vähän geenimallin monistumista (amplifikaatio);
Liian paljon ei-kohdegeenin monistumista.
Lisäaineiden käyttö on yksi yleisimmistä strategioista näiden ongelmien ratkaisemiseksi.Yleensä lisäaineilla on kaksi näkökohtaa:
toissijainen rakennegeenien (toissijainen rakenne);
Vähennä epäspesifistä esikäsittelyä.
Tänään toimittaja esittelee lyhyesti PCR-reaktioiden yleisimmät lisäaineet ja niiden toiminnot.
Lisäaineet, jotka vähentävät toissijaista rakennetta
sulfoksidi(DMSO)
geeninäytteetkorkea GC-pitoisuus.DMSO vähentää kuitenkin myös suuresti Taq-polymeraasiaktiivisuutta.Siksi jokaisen on tasapainotettava templaatin saavutettavuus ja polymeraasin aktiivisuus.Toimittaja ehdottaa, että voit kokeilla erilaisia ​​DSMO-pitoisuuksia, kuten 2–10%, löytääksesi kokeellesi sopivan pitoisuuden.
Ionittomat pesuaineet
Ionittomat pesuaineet, kuten 0,1-1 % Triton X-100, Tween 20 tai NP-40, heikentävät yleensä DNA:n sekundaarirakennetta.Vaikka tämä voi lisätä templaattigeenin monistumista, se aiheuttaa myös epäspesifisen monistumisen ongelmia.Joten nämä lisäaineet toimivat hyvin pienisaantoisissa PCR-reaktioissa ilman roskia, mutta eivät niin hyvin suhteellisen epäpuhtaissa PRC-reaktioissa.Toinen ionittomien pesuaineiden etu on SDS-kontaminaation vähentäminen.Yleensä DNA-uuttoprosessin aikana SDS tuodaan PCR-vaiheeseen, mikä estää suuresti polymeraasin aktiivisuutta.Siksi 0,5 % Tween-20:n tai Tween-40:n lisääminen reaktioon voi neutraloida SDS:n negatiiviset vaikutukset.
Betaiini_
Betaiini voi parantaa DNA:n monistumista vähentämällä sekundaarirakenteen muodostumista, ja se on yleensä "mysteeri" lisäys kaupallisiin PCR-pakkauksiin.Jos haluat käyttää betaiinia, laita betaiinia tai betaiinimonohydraattia (betaiini tai betaiinimonohydraatti), mutta ei betaiinihydrokloridia (Betaine HCl), säädä lopulliseen pitoisuuteen 1-1,7 M.Betaiini voi myös auttaa parantamaan spesifisyyttä, koska se eliminoi DNA:n sulamisen/DNA:n denaturaation riippuvuuden emäsparikoostumuksesta.
Lisäaineet, jotka vähentävät epäspesifistä pohjustusta
formamidi
Foramidi on yleisesti käytetty orgaaninen PCR-lisäaine.Se voi yhdistyä DNA:n suuren uran ja pienemmän uran kanssa, mikä vähentää pää-DNA:n kaksoiskierteen stabiilisuutta ja alentaa DNA:n sulamislämpötilaa.PCR-kokeissa käytetyn formamidin pitoisuus on yleensä 1-5 %.
Tetrametyyliammoniumkloridi( TMAC)
Tetrametyyliammoniumkloridi voi lisätä hybridisaation spesifisyyttä (hybridisaatiospesifisyyttä) ja nostaa DNA:n sulamislämpötilaa.Siten TMAC voi poistaa epäspesifisen alukkeen ja vähentää DNA:n ja RNA:n väärinsitoutumista.Jos käytätrappeutuneet alukkeetmuista lisätä PCR-reaktiossa TMAC:tä, jota käytetään yleisesti pitoisuutena 15-100 mM.
Muut yleiset lisäaineet
Edellä mainittujen kahden lisäaineluokan lisäksi PCR-reaktioissa on monia yleisiä lisäaineita, vaikka niillä on erilaisia ​​tehtäviä, ne ovat myös erittäin tärkeitä.
Magnesiumioni
Magnesiumioni on polymeraasin välttämätön kofaktori (kofaktori), eli ilman magnesium-ionia polymeraasi on inaktiivinen.Liian paljon magnesiumioneja voi kuitenkin myös vaikuttaa polymeraasin tehokkuuteen.Magnesiumi-ionien pitoisuus kussakin PCR-reaktiossa vaihtelee.Kelatointiaineet (kuten EDTA tai sitraatti), dNTP:iden ja proteiinien pitoisuus vaikuttavat kaikki magnesium-ionien pitoisuuteen.Joten jos sinulla on ongelmia PCR-kokeen kanssa, voit yrittää muuttaa erilaisia ​​magnesiumionipitoisuuksia, esimerkiksi 1,0:sta 4,0 mM:iin, 0,5–1 mM:n välein.
On syytä huomata, että useat jäädytys-sulatusjaksot voivat johtaa magnesiumkloridiliuoksen pitoisuuskerrostumiseen.Siksi sinun on liuotettava se kokonaan ennen jokaista käyttöä ja sekoitettava hyvin ennen käyttöä.
Naudan seerumin albumiini(Naudan albumiini, BSA)
Molekyylikemian kokeissa naudan seerumin albumiini on hyvin yleinen lisäaine, erityisesti restriktioentsyymidigestio- ja PCR-kokeissa.PCR-reaktioissa BSA auttaa vähentämään kontaminantteja, kuten fenoliyhdisteitä.Ja sanotaan myös, että se voi vähentää reagoivien aineiden tarttumista koeputken seinämään.PCR-reaktiossa lisätyn BSA:n pitoisuus voi tavallisesti saavuttaa 0,8 mg/ml.
 
Liittyvät tuotteet:
PCR-sankari(väriaineen kanssa)
PCR-sankari