Alukkeiden ja koettimien suorituskyvyn varmistaminen PCR-reagenssien varhaisessa vaiheessa ja sopivimpien reaktio-olosuhteiden määrittäminen ovat edellytyksiä muodollisten kokeiden sujuvan etenemisen varmistamiseksi.
Joten kuinka meidän on vahvistettava alukeanturi varhaisessa vaiheessa?
Tärkeimmät indikaattorit ovat perusviiva, vahvistuskäyrä, ct-arvo, vahvistuksen tehokkuus, matalapitoisuuden näytteen havaitseminen, CV jne.
Perustaso
Perusviiva on vaakasuora viiva PCR-amplifikaatiokäyrässä.PCR-monistusreaktion ensimmäisissä jaksoissa fluoresenssisignaali ei muutu paljon ja muodostaa suoran viivan.Tämä suora on perusviiva.
Kun seulotaan PCR-alukekoettimia, kiinnitä huomiota siihen, onko perusviiva tasainen.Alukekoettimen pitoisuuden puhtaus vaikuttaa perusviivaan, kuten aiheuttaa perusviivan nousun tai laskun.Perustaso on myös erittäin intuitiivinen indikaattori.
Vahvistuskäyrä
Toinen intuitiivinen indikaattori on vahvistuskäyrän muoto.On parasta käyttää S-muotoista käyrää, jotta vältetään toissijainen vahvistus tai muut epänormaalit vahvistuskäyrät.
Ct-arvo
Käännepistettä perusviivasta eksponentiaaliseen kasvuun vastaava syklien lukumäärä on Ct-arvo.
Samalle näytteelle eri alukekoettimet johtavat erilaisiin amplifikaatiokäyriin, ja vastaavaan Ct-arvoon vaikuttavat amplifikaatiotehokkuus ja häiriöaste.Teoriassa mitä pienempi valitsemamme alukeanturin Ct-arvo, sitä parempi.
Vahvistustehokkuus
Yksi luotettavimmista ja vakaimmista menetelmistä PCR-monistuksen tehokkuuden arvioimiseksi on standardikäyrä, joka on myös tutkijoiden laajalti tunnustama.Menetelmään kuuluu näytteiden sarjan tekeminen kohdemallien suhteellisen määrän hallitsemiseksi.Nämä näytteet valmistetaan yleensä sarjalaimennuksilla väkevistä kantaliuoksista, yleisimmin käytetty on 10-kertainen laimennos.Käyttämällä sarjaa laimennettuja näytteitä, käyttämällä tavallista qPCR-ohjelmaa vahvistamaan Cq-arvon saamiseksi ja piirtämällä lopuksi standardikäyrä kunkin näytteen pitoisuuden ja vastaavan Cq-arvon mukaan, jotta saadaan lineaarinen yhtälö Cq= -klgX0+b ja vahvistusteho E=10(-1 /k)-1.Käytettäessä qPCR:ää kvantitatiiviseen analyysiin, monistustehokkuuden on oltava alueella 90–110 % (3,6>k>3,1).
Matalapitoisuuden näytteiden tunnistus
Kun näytepitoisuus on alhainen, eri alukekoettimien havaitsemisnopeudet ovat erilaisia.Valitsemme replikoitavaksi 20 alhaisen pitoisuuden omaavaa näytettä, ja aluke-koetinjärjestelmä, jolla on suurin havaitsemisnopeus, on paras.
Variaatiokerroin (CV)
10 kaksoisnäytettä voidaan havaita erilaisilla alukekoettimilla nukleiinihappomonistuksen havaitsemiseen tarkoitetun reagenssin linjastandardin mukaisesti.
Kvantitatiiviset reagenssit:
Tarkkuus
Yhden erän tarkkuuden tulee täyttää: testipitoisuuden logaritmisen arvon variaatiokerroin (CV, %) on ≤5 %.Kun näytepitoisuus on pieni, havaitsemispitoisuuden logaritmin variaatiokerroin (CV,%) on ≤10 %
Laadulliset reagenssit:
Tarkkuus
Yhden erän tarkkuuden tulee olla:
(1) Ct-arvon variaatiokerroin (CV, %) ≤5 %
Samaa näytettä testataan rinnakkain 10 kertaa, ja testitulosten tulee olla yhdenmukaisia
Postitusaika: 18.9.2021
