Lähtömateriaali: RNA
Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR (RT-qPCR) on kokeellinen menetelmä, jota käytetään PCR-kokeissa käyttäen RNA:ta lähtöaineena.Tässä menetelmässä kokonais-RNA tai lähetti-RNA (mRNA) transkriptoidaan ensin komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA) käänteiskopioijaentsyymin avulla.Sen jälkeen suoritettiin qPCR-reaktio käyttämällä cDNA:ta templaattina.RT-qPCR:ää on käytetty useissa molekyylibiologian sovelluksissa, mukaan lukien geeniekspressioanalyysi, RNA-häiriöiden validointi, mikrosiruvalidointi, patogeenien havaitseminen, geneettinen testaus ja sairaustutkimus.
Yksivaiheiset ja kaksivaiheiset menetelmät RT-qPCR:lle
RT-qPCR voidaan suorittaa yksivaiheisella tai kaksivaiheisella menetelmällä.Yksivaiheinen RT-qPCR yhdistää käänteistranskription ja PCR-monistuksen, jolloin käänteistranskriptaasi ja DNA-polymeraasi voivat saattaa reaktion loppuun samassa putkessa samoissa puskuriolosuhteissa.Yksivaiheinen RT-qPCR vaatii vain sekvenssispesifisten alukkeiden käyttöä.Kaksivaiheisessa RT-qPCR:ssä käänteistranskriptio ja PCR-amplifikaatio suoritetaan kahdessa putkessa käyttämällä erilaisia optimoituja puskureita, reaktio-olosuhteita ja alukkeen suunnittelustrategioita.
| Etu | Epäkohta | |
| Yksi askel | Tällä menetelmällä on vähemmän kokeellista virhettä, koska molemmat reaktiot suoritetaan yhdessä putkessa
Vähemmän pipetointivaiheita vähentää kontaminaatioriskiä
Soveltuu suuritehoiseen vahvistukseen/seulomiseen, nopea ja toistettava | Kaksivaiheisia reaktioita ei voida optimoida erikseen
Koska reaktio-olosuhteet vaarantuvat yhdistämällä kaksivaiheinen reaktio, herkkyys ei ole yhtä hyvä kuin kaksivaiheisen menetelmän.
Yhdellä näytteellä havaittujen kohteiden määrä on pieni |
| Kaksi askelta | Kyky luoda stabiileja cDNA-kirjastoja, joita voidaan säilyttää pitkiä aikoja ja käyttää useissa reaktioissa
Kohdegeenit ja vertailugeenit voidaan monistaa samasta cDNA-kirjastosta ilman useiden cDNA-kirjastojen tarvetta
Reaktiopuskurit ja reaktio-olosuhteet, jotka mahdollistavat yksittäisten reaktioajojen optimoinnin
Joustava laukaisuehtojen valinta | Useiden putkien ja useiden pipetointivaiheiden käyttö lisää DNA-kontaminaation riskiä, ja aikaa vievää.
Vaatii enemmän optimointia kuin yksivaiheinen menetelmä |
Liittyvät tuotteet:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Vihreä I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Ensimmäisen juosteen CDNA-synteesiin
Reaaliaikainen PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Reaaliaikainen PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Kokonais-RNA:n ja mRNA:n valinta
RT-qPCR-koetta suunniteltaessa on tärkeää päättää, käytetäänkö käänteistranskription templaattina kokonais-RNA:ta vai puhdistettua mRNA:ta.Vaikka mRNA voi kyetä tarjoamaan hieman korkeamman herkkyyden, kokonais-RNA:ta käytetään edelleen usein.Syynä tähän on se, että kokonais-RNA:lla on tärkeämpi etu lähtöaineena kuin mRNA:lla.Ensinnäkin prosessi vaatii vähemmän puhdistusvaiheita, mikä varmistaa templaatin paremman kvantitatiivisen talteenoton ja tulosten paremman normalisoinnin aloitussolujen lukumäärään.Toiseksi se välttää mRNA:n rikastusvaiheen, joka voi välttää vääristyneiden tulosten mahdollisuuden eri mRNA:iden erilaisista talteenotoista johtuen.Kaiken kaikkiaan, koska useimmissa sovelluksissa kohdegeenin suhteellinen kvantifiointi on tärkeämpää kuin havaitsemisen absoluuttinen herkkyys, kokonais-RNA on sopivampi useimmissa tapauksissa.
Käänteistranskription aluke
Kaksivaiheisessa menetelmässä voidaan käyttää kolmea eri menetelmää cDNA-reaktion pohjustamiseen: oligo(dT)-alukkeita, satunnaisia alukkeita tai sekvenssispesifisiä alukkeita.Tyypillisesti oligo(dT)-alukkeita ja satunnaisia alukkeita käytetään yhdistelmänä.Nämä alukkeet pariutuvat templaatti-mRNA-juosteeseen ja tarjoavat käänteistranskriptaasin synteesin aloituskohdan.
| Pohjamaalin valinta | Rakenne ja toiminta | Etu | Epäkohta |
| Oligo(dT)-aluke (tai ankkuroitu oligo(dT)-aluke) | Laajennettu pariutuminen tymiinitähteisiin mRNA:n poly(A)-hännän kohdalla;ankkurioligo(dT)-aluke sisältää G:n, C:n tai A:n 3'-päässä (ankkurikohta) | Täyspitkän cDNA:n synteesi poly(A)-häntäisestä mRNA:sta
Sovelletaan, kun saatavilla on vähemmän lähtöainetta
Ankkurointikohta varmistaa, että oligo(dT)-aluke sitoutuu mRNA:n 5' poly(A)-häntään | Soveltuu vain poly(A)-häntäisten geenien monistamiseen
Hanki cDNA, joka on katkaistu poly(A)-pohjustuskohdasta*2
Painettu sitoutumaan 3′-päähän*
*Tämä mahdollisuus on minimoitu, jos käytetään ankkuroituja oligo(dT)-alukkeita |
| satunnainen aluke
| 6-9 emäksen pituiset, jotka voivat liittyä useisiin kohtiin RNA-transkription aikana | Liittyy kaikkiin RNA:ihin (tRNA, rRNA ja mRNA)
Soveltuu transkriptioihin, joissa on merkittävä sekundaarirakenne, tai kun lähtömateriaalia on saatavilla vähemmän
Korkea cDNA-saanto | cDNA käänteiskopioituu kaikesta RNA:sta, mikä ei yleensä ole toivottavaa ja saattaa laimentaa kohde-mRNA:n signaalia
saada katkaistu cDNA |
| sekvenssispesifiset alukkeet | Mukautetut alukkeet, jotka kohdistuvat tiettyihin mRNA-sekvensseihin | spesifinen cDNA-kirjasto
Paranna herkkyyttä
Käänteisten qPCR-alukkeiden käyttö | Rajoitettu vain yhden kohdegeenin synteesiin |
Käänteinen transkriptaasi
Käänteistranskriptaasi on entsyymi, joka käyttää RNA:ta DNA:n syntetisoimiseen.Joillakin käänteistranskriptaaseilla on RNaasi-aktiivisuutta ja ne voivat hajottaa RNA-säikeitä RNA-DNA-hybridijuosteissa transkription jälkeen.Jos sillä ei ole RNase-entsymaattista aktiivisuutta, RNaseH voidaan lisätä qPCR-tehokkuuden parantamiseksi.Yleisesti käytettyjä entsyymejä ovat Moloney hiiren leukemiaviruksen käänteiskopioija ja linnun myeloblastoomaviruksen käänteiskopioija.RT-qPCR:lle on ihanteellinen valita käänteistranskriptaasi, jolla on korkeampi lämpöstabiilisuus, jotta cDNA-synteesi voidaan suorittaa korkeammissa lämpötiloissa, mikä varmistaa korkeamman sekundaarirakenteen omaavien RNA:iden onnistuneen transkription säilyttäen samalla niiden täyden aktiivisuuden koko reaktion ajan, mikä johtaa korkeampiin cDNA-saantoihin.
Liittyvät tuotteet:
Foreasy M-MLV -käänteiskopioija
Käänteistranskriptaasin RNaasi H -aktiivisuus
RNaseH pystyy hajottamaan RNA-säikeitä RNA-DNA-duplekseista, mikä mahdollistaa kaksijuosteisen DNA:n tehokkaan synteesin.Kuitenkin, kun käytetään pitkää mRNA:ta templaattina, RNA voi hajota ennenaikaisesti, mikä johtaa typistettyyn cDNA:han.Siksi on usein hyödyllistä minimoida RNaseH-aktiivisuus cDNA-kloonauksen aikana, jos pitkien transkriptien synteesi halutaan.Sitä vastoin käänteistranskriptaasit, joilla on RNaasi H -aktiivisuutta, ovat usein hyödyllisiä qPCR-sovelluksissa, koska ne tehostavat RNA-DNA-dupleksien sulamista PCR:n ensimmäisen syklin aikana.
Pohjamaalisuunnittelu
RT-qPCR:n qPCR-vaiheessa käytetyt PCR-alukkeet tulisi ihanteellisesti suunnitella kattamaan eksoni-eksoni -liitoksen, jossa monistusaluke voisi mahdollisesti kattaa todellisen eksoni-intronin rajan.Koska intronia sisältäviä genomisia DNA-sekvenssejä ei amplifioida, tämä suunnittelu vähentää väärien positiivisten monistumisen riskiä kontaminoivasta genomisesta DNA:sta.
Jos alukkeita ei voida suunnitella erottamaan eksoneja tai eksoni-eksonirajoja, voi olla tarpeen käsitellä RNA-näytteitä RNaasi-vapaalla DNaasi I:llä tai dsDNaasilla genomisen DNA-kontaminaation poistamiseksi.
RT-qPCR-ohjaus
Käänteistranskription negatiivinen kontrolli (-RT-kontrolli) tulee sisällyttää kaikkiin RT-qPCR-kokeisiin DNA-kontaminaation (kuten genomisen DNA:n tai aikaisempien reaktioiden PCR-tuotteiden) havaitsemiseksi.Tämä kontrolli sisältää kaikki reaktiokomponentit paitsi käänteistranskriptaasia.Koska käänteistranskriptiota ei tapahdu tällä kontrollilla, jos PCR-monistumista havaitaan, DNA:n kontaminaatio on todennäköisintä.
Postitusaika: 02.08.2022
