Useita vallankumouksellisia keksintöjä havaitsemistekniikan historiassa mielessäni ovat antigeeni-vasta-ainespesifisen sitoutumisen periaatteeseen perustuva immunoleimaustekniikka, PCR-tekniikka ja sekvensointitekniikka.Tänään puhumme PCR-tekniikasta.PCR-tekniikan kehityksen mukaan ihmiset jakavat tavallisesti PCR-teknologian kolmeen sukupolveen: tavalliseen PCR-tekniikkaan, reaaliaikaiseen fluoresoivaan kvantitatiiviseen PCR-tekniikkaan ja digitaaliseen PCR-tekniikkaan.
Cyleinen PCR-tekniikka
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis keksi polymeraasiketjureaktion (polymeraasiketjureaktio, PCR) vuonna 1983. Sanotaan, että kun hän ajoi tyttöystäväänsä, hän yhtäkkiä inspiroi ja ajatteli PCR:n periaatetta (ajon eduista).Kary Mullis sai Nobelin kemian palkinnon vuonna 1993. New York Times kommentoi: "Erittäin omaperäinen ja merkittävä, melkein jakaa biologian PCR:ää edeltävään ja PCR:n jälkeiseen aikakauteen.
PCR:n periaate: DNA-polymeraasin katalyysin alaisena emäjuosteen DNA:ta käytetään templaattina ja spesifistä aluketta käytetään pidentämisen aloituspisteenä ja emäjuosteen templaatti-DNA:lle komplementaarista tytärjuoste-DNA:ta kopioidaan in vitro denaturoinnin, pariutumisen, pidentämisen ja muiden vaiheiden kautta.Se on DNA-synteesin monistustekniikka in vitro, joka voi nopeasti ja spesifisesti monistaa minkä tahansa kohde-DNA:n in vitro.
Tavallisen PCR:n edut
1.Klassinen menetelmä, täydelliset kansainväliset ja kotimaiset standardit
2.Instrumenttireagenssien alhaisemmat kustannukset
3.PCR-tuotteet voidaan ottaa talteen muita molekyylibiologisia kokeita varten
Suositeltu Foregene PCR -kone: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Liittyvät tuotteet: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Tavallisen PCR:n haitat
1.helppo saastuttaa
2.hankala operaatio
3.vain laadullinen analyysi
4.Kohtalainen herkkyys
5.On epäspesifistä vahvistusta, ja kun epäspesifinen kaista on samankokoinen kuin kohdekaista, sitä ei voida erottaa
Capillaarielektroforeesiin perustuva PCR
Vastauksena tavallisen PCR:n puutteisiin jotkut valmistajat ovat ottaneet käyttöön instrumentteja, jotka perustuvat kapillaarielektroforeesin periaatteeseen.Elektroforeesivaihe PCR-monistuksen jälkeen on suoritettu kapillaarissa.Herkkyys on suurempi ja MAERKER pystyy erottamaan useiden emästen eron ja laskemaan vahvistuksen.tuotteen sisältö.Haittapuolena on, että PCR-tuote on vielä avattava ja asetettava instrumenttiin, ja kontaminaatioriski on edelleen suuri.
CapillaariEelektroforeesi
2. Reaaliaikainen fluoresoiva kvantitatiivinen PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluoresoiva kvantitatiivinen PCR, jota kutsutaan myös Real-Time PCR:ksi, on PE (Perkin Elmer) vuonna 1995 kehittämä uusi nukleiinihappojen kvantitatiivinen tekniikka. Fluoresoivan kvantitatiivisen PCR:n kehityshistoria on historiaa ABI:n, Rochen ja Bio-Radin kaltaisten jättiläisten sielua koskevista kamppailuista.Jos olet kiinnostunut, voit tarkistaa sen.Tämä tekniikka on tällä hetkellä kypsin ja laajimmin käytetty puolikvantitatiivinen PCR-tekniikka.
Suositeltu qPCR-kone: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluoresoiva väriainemenetelmä (SYBR Green I):SYBR Green I on yleisimmin käytetty DNA:ta sitova väriaine kvantitatiivisessa PCR:ssä, joka sitoutuu epäspesifisesti kaksijuosteiseen DNA:han.Vapaassa tilassa SYBR Green emittoi heikkoa fluoresenssia, mutta kun se on sitoutunut kaksijuosteiseen DNA:han, sen fluoresenssi kasvaa 1000-kertaiseksi.Siksi reaktion lähettämä fluoresoiva kokonaissignaali on verrannollinen läsnä olevan kaksijuosteisen DNA:n määrään ja kasvaa monistetun tuotteen lisääntyessä.Koska väriaine sitoutuu epäspesifisesti kaksijuosteiseen DNA:han, voidaan tuottaa vääriä positiivisia tuloksia.
Liittyvät tuotteet: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluoresoiva koetinmenetelmä (Taqman-tekniikka): AikanaPCR-monistus, spesifinen fluoresoiva koetin lisätään samaan aikaan kuin alukepari.Koetin on lineaarinen oligonukleotidi, jonka molemmissa päissä on leimattu fluoresoiva reportteriryhmä ja fluoresoiva sammuttajaryhmä.Kun koetin on ehjä, sammuttajaryhmä absorboi reportteriryhmän lähettämän fluoresoivan signaalin ja havaitseminen Fluoresoivaa signaalia ei ole;PCR-monistuksen aikana (pidennysvaiheessa) Taq-entsyymin 5'-3' Dicer-aktiivisuus pilkkoo ja hajottaa koettimen siten, että reportterifluoresoiva ryhmä ja sammuttajafluoresoiva ryhmä erotetaan toisistaan, jolloin fluoresenssin seurantajärjestelmä Fluoresenssisignaali voidaan vastaanottaa, eli joka kerta, kun muodostuu DNA-ketju, synkronisoituu fluoresoiva ketju, joka toteutuu fluoresoivien signaalien ja PCR-tuotteiden muodostumisen.Taqman-koetinmenetelmä on yleisimmin käytetty havainnointimenetelmä kliinisessä havaitsemisessa.
Aiheeseen liittyviä tuotteita: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR:n edut
1.Menetelmä on kypsä ja tukilaitteet ja reagenssit ovat valmiit
2.Keskimääräiset reagenssikustannukset
3.helppokäyttöinen
4.Korkea tunnistusherkkyys ja spesifisyys
qPCR:n haitat
Kohdegeenin mutaatio johtaa havaitsematta jättämiseen.
Pienen pitoisuuden mallin tunnistustulosta ei voida määrittää.
Käytettäessä standardikäyrää kvantitatiiviseen havaitsemiseen on suuri virhe.
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) -tekniikka
Digitaalinen PCR on tekniikka nukleiinihappomolekyylien absoluuttiseen kvantifiointiin.Verrattuna qPCR:ään, digitaalinen PCR voi lukea suoraan DNA/RNA-molekyylien lukumäärän, joka on lähtönäytteen nukleiinihappomolekyylien absoluuttinen kvantifiointi.Vuonna 1999 Bert Vogelstein ja Kenneth W. Kin-zler ehdottivat virallisesti dPCR-konseptia.
Vuonna 2006 Fluidigm tuotti ensimmäisenä kaupallisen sirupohjaisen dPCR-instrumentin.Life Technologies julkaisi vuonna 2009 OpenArray- ja QuantStudio 12K Flex dPCR -järjestelmät.Life Technologies lanseerasi vuonna 2013 QuantStudio 3DdPCR -järjestelmän, joka käyttää korkeatiheyksistä nanomittakaavan mikrofluidisiruteknologiaa jakaakseen näytteet tasaisesti 20 000 yksittäiseen soluun.reaktiokaivossa.
Vuonna 2011 Bio-Rad toi markkinoille pisarapohjaisen QX100 dPCR -laitteen, joka käyttää vesi öljyssä -tekniikkaa jakaakseen näytteen tasaisesti 20 000 pisara-vesi öljyssä -menetelmään ja käyttää pisara-analysaattoria pisaroiden analysointiin.Vuonna 2012 RainDance lanseerasi korkeapainekaasulla toimivan RainDrop dPCR -laitteen, joka jakaa jokaisen vakioreaktiojärjestelmän reaktioemulsioksi, joka sisältää 1 miljoonasta 10 miljoonaan pikolitratason mikropisaroita.
Toistaiseksi digitaalinen PCR on muodostanut kaksi suurta ryhmää, sirutyypin ja pisaratyypin.Riippumatta siitä, millainen digitaalinen PCR on, sen perusperiaatteet ovat rajoittava laimennus, päätepiste-PCR ja Poisson-jakauma.Nukleiinihappotemplaatteja sisältävä standardi PCR-reaktiojärjestelmä on jaettu tasaisesti kymmeniin tuhansiin PCR-reaktioihin, jotka jakautuvat siruihin tai mikropisaroihin siten, että jokainen reaktio sisältää mahdollisimman paljon templaattimolekyyliä ja suoritetaan yhden molekyylin templaatti-PCR-reaktio.Lukemalla fluoresenssi Signaalin läsnäolo tai puuttuminen lasketaan ja absoluuttinen kvantifiointi suoritetaan tilastollisen Poisson-jakauman kalibroinnin jälkeen.
Seuraavat ovat useiden käyttämieni digitaalisten PCR-alustojen ominaisuudet:
1. Bio-Rad QX200 pisaradigitaalinen PCR Bio-RadQX200 on erittäin klassinen digitaalinen PCR-alusta, perustunnistusprosessi: pisarageneraattori tuottaa 20 000 näytettä Vesi-öljyssä -mikropisaroita vahvistetaan tavallisella PCR-koneella, ja lopuksi jokaisen mikropisaran fluoresenssisignaali luetaan mikropisaroiden lukijalla.Toiminta on monimutkaisempaa, ja saastumisriski on keskimääräinen.
Xinyi TD1 mikropisaroiden digitaalinen PCRXinyi TD1 on kotimainen digitaalinen PCR-alusta, perustunnistusprosessi: generoi 30 000-50 000 vesi öljyssä -pisaraa pisarageneraattorin kautta, vahvista yleisellä PCR-instrumentilla ja lopulta läpäisee Pisaranlukija lukee jokaisen pisaran fluoresoivan signaalin.Sekä pisaroiden luominen että lukeminen tällä alustalla suoritetaan erillisessä sirussa, jolla on pieni kontaminaatioriski.
STILLA Naica mikropisarasiru digitaalinen PCRSTILLA Naica on suhteellisen uusi digitaalinen PCR-alusta.Perustunnistusprosessi on: lisää reaktioliuos sirulle, laita siru mikropisaroiden muodostus- ja vahvistusjärjestelmään ja synnytä 30 000 mikropisaraa.Levitä sirulle ja PCR-amplifikaatio on valmis sirulle.Sitten vahvistettu siru siirretään mikropisaroiden lukuanalyysijärjestelmään ja fluoresoiva signaali luetaan ottamalla kuvia.Koska koko prosessi tapahtuu suljetussa sirussa, kontaminaatioriski on pieni.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D-siru digitaalinen PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D on toinen klassinen sirupohjainen digitaalinen PCR-alusta.Sen perustunnistusprosessi on: lisää reaktioliuos levittimeen ja levitä reaktioliuos tasaisesti sirulle 20 000 mikrokuoppaan levittimen läpi., aseta siru PCR-laitteeseen vahvistusta varten ja lopuksi aseta siru lukijaan ja ota valokuva lukeaksesi fluoresoivan signaalin.Toiminta on suhteellisen monimutkaista, ja koko prosessi suoritetaan suljetussa sirussa ja kontaminaatioriski on pieni.
5. JN MEDSYS Clarity siru digitaalinen PCR
JN MEDSYS Clarity on suhteellisen uusi sirutyyppinen digitaalinen PCR-alusta.Sen perustunnistusprosessi on: lisää reaktioliuos applikaattoriin ja levitä reaktioliuos tasaisesti 10 000 PCR-putkeen kiinnitettyyn PCR-putkeen applikaattorin läpi.Mikrohuokoisella sirulla reaktioliuos pääsee sirulle kapillaaritoiminnan kautta, ja PCR-putki sirulla asetetaan PCR-koneelle vahvistusta varten ja lopuksi siru laitetaan lukijaan lukemaan fluoresoiva signaali valokuvaamalla.Operaatio on monimutkaisempi.Saastumisriski on pieni.
Kunkin digitaalisen PCR-alustan parametrit on tiivistetty seuraavasti:
Digitaalisen PCR-alustan arviointiindikaattoreita ovat: jaettujen yksiköiden määrä, fluoresoivien kanavien määrä, toiminnan monimutkaisuus ja kontaminaatioriski.Mutta tärkeintä on havaitsemisen tarkkuus.Yksi tapa arvioida digitaalisia PCR-alustoja on käyttää useita digitaalisia PCR-alustoja toistensa varmentamiseen, ja toinen tapa on käyttää vakioaineita tarkoilla arvoilla.
dPCR:n edut
1.Absoluuttisen kvantifioinnin saavuttaminen
2.Korkeampi herkkyys ja spesifisyys
3.Pystyy havaitsemaan vähän kopioita olevia näytteitä
dPCR:n haitat1. Kalliit laitteet ja reagenssit 2. Monimutkainen toiminta ja pitkä tunnistusaika 3. Kapea tunnistusalue
Tällä hetkellä PCR-teknologian kolmella sukupolvella on omat hyvät ja huonot puolensa, ja jokaisella on omat sovellusalueet, eikä se ole suhde, että yksi sukupolvi korvaa toisen.Teknologian jatkuva kehitys on tuonut uutta elinvoimaa PCR-tekniikkaan, mikä mahdollistaa sen, että se voi avata yhden käyttösuunnan toisensa jälkeen, mikä tekee nukleiinihappojen havaitsemisesta helpompaa ja tarkempaa.
Lähde: Dr. Yuan vie sinut testaukseen
Suositellut tuotteet:
Postitusaika: 18.11.2022
